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  辰琉偲 2017-07-12 00:00:00

  試劑準(zhǔn)備：使用前先在SEWS-M Wash Solution中加入100 ml 的乙醇，混勻。在瓶子上做好標(biāo)記，密閉儲(chǔ)存于室溫條件。提取步驟：1. 在樣品處理管E中加入至多500 mg的土壤樣品2. 將978 μl的Sodium Phosphate Buffer加入到樣品處理管E中3. 再加入122 μl的 MT Buffer （為了得到良好的樣品處理效果，請(qǐng)?jiān)诩尤胪寥罉悠芳皟蓚€(gè)緩沖液后，在樣品處理管中仍能保留有250 – 500μl 空間）4. 將樣品置于FastPrep? 儀器上，樣品處理?xiàng)l件一般為，時(shí)間：40秒，速度：6.0（如果樣品需要額外的處理時(shí)間，請(qǐng)?jiān)陂g隔期將樣品處理管在冰上孵育至少2分鐘，以免樣品過熱）5. 14，000 x g離心5~10分鐘（如果把離心時(shí)間延長到15分鐘，可以更好地使樣品量較大的；或者細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的細(xì)胞的碎片沉降到管底）6. 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2.0 ml離心管中。加入250μL的PPS溶液（蛋白質(zhì)沉淀溶液），用手搖晃10次，使之充分的混合。7. 14，000 x g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的15ml管中(此處也可使用2Ml管，但使用大管子能獲得更好的混合和DNA綁定效果)8. 重懸硅珠（Binding Matrix）溶液，將1.0 ml重懸液加入該15ml管中。9. 使用振蕩器或者手動(dòng)震蕩2分鐘，將DNA綁定在硅珠上。將管子置于管架上，靜置3分鐘，使硅珠沉淀下來。10. 小心地移除500μl的上清液，避免吸取到沉淀下來的硅珠。11. 將硅珠在剩余的上清液中重懸。轉(zhuǎn)移約600μl的重懸液至SPIN? Filter中，14，000 x g離心1分鐘。棄去接液管中的廢液，將15ml管中剩余的重懸液轉(zhuǎn)移到SPIN? Filter再次離心棄去廢液。12. 加入500 μl事先準(zhǔn)備好的SEWS-M溶液，用槍頭輕輕吹打，小心地重懸沉淀。13. 14，000 x g離心1分鐘，棄去廢液。14. 不加其他溶液，將SPIN? Filter 14，000 x g離心2分鐘，除去殘留的SEWS-M溶液。棄去接液管，更換一個(gè)新的、干凈的離心管。15. 將SPIN? Filter置于室溫下晾干5分鐘16.輕輕地用50-100 μl 的DES溶液（或者無菌/無DNA酶的水）重懸SPIN filter上的硅珠（為了避免過度稀釋純化出的DNA，請(qǐng)盡量減少DES溶液的量，55?C孵育5分鐘能幫助提高純化產(chǎn)物的得率）17. 14，000 x g離心1分鐘使溶解的DNA轉(zhuǎn)移到接液管中。棄去SPIN? Filter（得到的純化產(chǎn)物可直接用于PCR等其他下游的操作，4°C使用前保存或者-20°C長期保存。）技術(shù)優(yōu)勢 能有效的處理土壤樣品中一些很難處理的組分如： 真細(xì)菌孢子（eubacterial spores）、內(nèi)芽孢（endospores）、格蘭仕陽性菌（gram positive bacteria）、酵母（yeast）、線蟲（nematodes）、海藻（algea）、真菌（fungi）等。2. 樣品處理過程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整個(gè)提取過程中有效的保護(hù)核酸，并Z大限度的降低RNA污染。3. 基于硅珠的純化方法，可有效地去除腐植酸、多元酚等PCRYZ物4. 純化所得的DNA可直接用于PCR、酶切都后續(xù)實(shí)驗(yàn)之中。5. 對(duì)腐植酸含量特別高的樣品，附加額外的處理方法。注：對(duì)于去除腐植酸的方法在使用以下任何一種方法之前，請(qǐng)預(yù)先準(zhǔn)備5.5M的異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）溶液方法A：1.當(dāng)操作到土壤DNA提取試劑盒的第九步時(shí)，使用14，000 x g (~約5秒)的短時(shí)離心替代硅珠的自然沉降，移除上清。2.用1ml事先準(zhǔn)備好的異硫氰酸胍溶液洗滌、重懸硅珠。3.14，000 x g (~約5秒)短時(shí)離心該離心管，除去上清。4.重復(fù)上述的洗滌步驟，直到硅珠恢復(fù)到原先的顏色。5.Z后一次洗滌之后，用1ml的異硫氰酸胍溶液重懸硅珠，將600μl重懸液轉(zhuǎn)移到SPIN filter里，14，000 x g離心1分鐘。6.移除接液管中的廢液，將剩余的重懸液轉(zhuǎn)移至SPIN filter里，14，000 x g離心1分鐘，棄去廢液。7.從提取試劑盒操作說明的第十二步開始繼續(xù)操作。方法B：1.將下列成分混合于1.5ml的離心管中，組成腐植酸洗滌液：978 μl Sodium Phosphate Buffer122 μl MT Buffer250 μl PPS2.充分混勻后，全速離心1分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中（容量大于或等于2ml）3.加入等體積的5.5M的異硫氰酸胍溶液、混勻。4.完成了土壤試劑盒操作說明中的第九步后，將500μl的腐植酸洗滌液加入SPIN filter5.14，000 x g離心1分鐘，棄去廢液。6.重復(fù)上述的洗滌步驟，直到硅珠恢復(fù)到原先的顏色。7.從提取試劑盒操作說明的第十二步開始繼續(xù)操作。

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