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  可愛的好事 2016-06-23 00:00:00

  植物基因組DNA提取試劑盒使用方法如下： 操作步驟：使用前先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。 1、植物組織預處理：取新鮮植物組織（不超過100mg）或干重組織（不超過20mg），于液氮中充分研磨至細粉狀，讓液氮自然揮發(fā)。 2、將研磨好的植物組織粉末迅速轉移到預先裝有400ul溶液PA、20ul RNase A（10mg/ml）和5ul β-巰基乙醇的離心管中，充分顛倒混勻，室溫放置10min。 3、加入140ul溶液PB，充分顛倒混勻，12000rpm離心10min，將上清轉移至新離心管中(約400-500ul)，注意不要吸入沉淀。 4、加入和上清相同體積的溶液PC，充分顛倒混勻，再加入和溶液PC相同體積的無水乙醇，此時若出現(xiàn)絮狀物，將絮狀物吹散后一起加入吸附柱中，12000rpm離心5min，棄廢液，一次加不完可分兩次加入。注意：如果吸附柱膜呈綠色或離心時有堵塞現(xiàn)象，可向吸附柱中加入600ul無水乙醇，并適當延長離心時間。 5、 向吸附柱中加入600ul漂洗液(請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。 6、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中， 12000rpm離心2min。 7、將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，否則殘余的乙醇可能會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。 8、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜ZY懸空滴加50-200ul經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置1-5min，12000rpm離心2min，即可得到高質量的植物基因組DNA。 9、(可選)離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心2min。 注意事項： 1、組織應盡量選取新鮮幼嫩樣本，富含多糖多酚的組織可能會提取失敗，請選用多糖多酚專用試劑盒。 2、如果試劑盒中的試劑出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中融化，不影響使用。 3、洗脫緩沖液的體積不能小于50ul，DNA產物應-20℃保存。 動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒使用步驟如下： 操作步驟： 使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入休積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。 1、樣品的處理： a、細胞：取1×106-1×107個懸浮培養(yǎng)細胞，12000rpm離心1min收集細胞，貼壁細胞先用胰蛋白酶消化處理，再用預冷的PBS吹打成細胞懸液，然后12000rpm離心1min收集細胞，盡量除去上清，加200ul溶液A，振蕩至徹底混勻。 b、組織：組織量不宜過大，一般不要超過25mg，可以使用勻漿器勻漿，Z好用液氮研磨成粉末狀，再用預冷的PBS或無菌水充分懸浮，然后12000rpm離心1min收集細胞，盡量除去上清，加200ul溶液A，振蕩至徹底混勻。 2、向懸浮液中加入20ul 的RNase A (10mg/ml)，55℃放置15min。 3、加入20ul 的蛋白酶K( 10mg /ml )，充分顛倒混勻，55℃水浴消化，細胞消化時間較短，組織消化時間較長，一般需要1-3個小時才能完成（鼠尾需要消化過夜）。消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直至樣品消化完全為止。消化完全的指標是：液體清亮及粘稠。 4、加入200ul體積溶液B，充分顛倒混勻，如出現(xiàn)白色沉淀，可放置于75℃ 15-30min，沉淀即會消失，不影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能導致提取的DNA量少及不純，還有可能導致堵塞吸附柱。 5、加入200ul無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中。 6、12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)， 12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 9、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。 10、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜ZY懸空滴加50-200ul經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心2min。 11、可將離心所得洗脫液再加入吸附柱中，12000rpm離心2min，即可得到高質量的基因組DNA。 注意事項: 1、試劑盒拆封后，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。 2、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。 3、如果試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響效果。 4、洗脫緩沖液的體積Z好不少于50ul，體積過小會影響回收效率：洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)，pH 值低于7.0會降低洗脫效率。 細菌基因組DNA提取試劑盒使用方法如下： 操作步驟： 使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。 所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。 1、取細菌培養(yǎng)液1ml，12000rpm離心1min.，盡量吸除上清。 2、向菌體中加入200ul溶液A，振蕩或用移液器吹打使菌體充分懸?。ㄈ绻歉锾m氏陽性菌，可在此步驟加入終濃度為20mg/ml的溶菌酶），向懸浮液中加入20ul的RNase A (10mg/ml)，充分顛倒混勻，室溫放置15-30min。 3、向管中加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分混勻，55℃消化30-60min，消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直至樣品消化完全為止，此時可見菌液呈清亮粘稠狀。 4、向管中加入200ul溶液B，充分顛倒混勻，如出現(xiàn)白色沉淀，可于75℃放置15-30min，沉淀即會消失，不影響后續(xù)實驗。如果溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能會導致DNA的提取量以及純度降低，還可能堵塞吸附柱。 5、向管中加入200ul無水乙醇，充分混勻，此時還可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入到吸附柱中，靜置2min。 6、12000rpm離心2min. 棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前請先檢查是否己加入無水乙醇)。12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入600ul漂洗液， 12000rpm離心l min， 棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 9、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)實驗如酶切、PCR等。 10、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜ZY懸空滴加50-200ul經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min。 11、離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min ，12000rpm離心2 min，即可得到高質量的細菌基因組DNA。 注意事項: 1、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量下降。 2、若試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。 3、如果實驗中的離心步驟出現(xiàn)柱子堵塞的情況，可適當延長離心時間。 4、洗脫緩沖液的體積Z好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)， pH值低于7. 0會降低洗脫效率。DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。 5、 DNA濃度及純度檢測：得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。 回收得到的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1.0相當于大約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA。OD260/0D280比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

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