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  剛剛有個感應 2009-12-15 00:00:00

  吸附層析固定相是固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力的差別而分離 分配層析固定相為液體，利用各組分在兩液相分配系數(shù)的差別或溶解度不同使物質分離 離子交換層析固定相為離子交換劑，利用各組分對離子交換劑的親和力不同而進行分離

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  清華708 2009-12-11 00:00:00

  　　離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂 。 　　離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質的分離純化。由于蛋白質也有等電點，當?shù)鞍踪|處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將 　　吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。 　?、彪x子交換劑預處理和裝柱對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使Z終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使Z終轉為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 　?、布訕优c洗脫加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。 　　洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中Z簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。Z好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放于同一水平上，diyi個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，diyi個容器與柱相連，當溶液由diyi容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經(jīng)攪拌與diyi容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。diyi容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算： 　　C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 　　式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。 　　洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。 　?、诚疵擆s份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。 　?、措x子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。 　?、惦x子交換層析的應用離子交換層析技術已廣泛用于各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。 　　概念 　　層析是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用于有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。 　　層析（chromatography）利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。 　　[編輯本段]語源學 　　chrome意為“色彩”，graphy源自希臘文，意為“寫”。色譜為層析的同義語，都是從英語chromatography譯來的。 　　層析（色譜） chromatograpby 　　在把微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統(tǒng)中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據(jù)移動相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當?shù)囊后w，也可使用其他物質。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一層薄而均的物質作為固定相的稱為薄層層析（thin-layer chromatography），后者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進行同樣的分析，即在固定相的一端，點上微量試料，在密閉容器中，使移動相（液體）從此端滲入，移動接近另一端。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測定進行鑒定。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當?shù)娘@色劑，或通過紫外燈下產生熒光的方法進行觀察。也可采用在diyi種移動相展開后再用另一移動相進行展開（這時的展開方向應與原方向垂直），使各成分分離完全的雙相層析（two-dimensional chromatography）。分離后，將斑點位置的固定相切取下來，把其中含有來自試料的物質提取進行定量分析。但為制備與定量，柱層析則更為適宜。在柱層析中，移動相從加入試料的一端展開到達另一端后，繼續(xù)展開使各成分和移動相一起向柱外分別溶出，這就是廣泛使用的所謂洗提層析（elution chromatography）。層析根據(jù)固定相與溶質（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型（離子交換層析）等三種類型。但這并不是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應的特定的酶或蛋白質。 　　[編輯本段]類別 　　◆按層析的機理劃分： 　　吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。 　　吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。 　　分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。 　　離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。 　　凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 　　◆按流動相與固定相的不同劃分： 　　氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區(qū)分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。 　　◆按操作形式劃分： 　　柱層析、紙層析、薄層層析、GX液相層析等。 　　柱層析：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 　　紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。 　　薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。 　　以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。 　　[編輯本段]基本原理 　　層析須在兩相系統(tǒng)間進行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動相，是液體或氣體。當流動相流經(jīng)固定相時，被分離物質在兩相間的分配，由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復平衡，即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過程。隨著流動相不斷向前流動，被分離物質間出現(xiàn)向前移動的速率差異，由開始的單一區(qū)帶逐漸分離出許多區(qū)帶，這個過程叫展層。 　　系數(shù)K是物質在兩相中的濃度比。K值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質間的K值差別大，則易被分離。不同類型層析的K值含義不同，可視為吸附平衡常數(shù)，分配常數(shù)或離子交換常數(shù)等。 　　研究層析現(xiàn)象而發(fā)展的塔板理論，與有機化學實驗中的分餾法原理有些相似。被分餾的有機溶劑在分餾柱內的填充物上形成許多熱交換層，從而把低沸點溶劑先分餾出來，達到純化的目的。在層析時用理論塔板數(shù)n來衡量層析效能。 　　tR為物質在層析柱上的保留時間，W為洗脫下來的物質峰形的寬度。n值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示，則包含了層析柱長度的因子。 　　式中L為層析柱的柱長。H值越大，則柱效越低。 　　此外影響層析分離效果的還有渦流擴散、縱向擴散和傳質阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能，流動相的層析系統(tǒng)和溫度等都是做好層析的關鍵。 　　[編輯本段]幾種常用的層析 　　◆吸附層析 　　吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力Z強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用于能溶于有機溶劑的有機化合物的分離，較少用于無機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數(shù)種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統(tǒng)，以獲得Z佳分離效果。 　　◆分配層析 　　在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等，這些親水物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區(qū)帶。 　　◆離子交換層析 　　支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對于蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù)，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。 　　◆凝膠過濾層析 　　支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內為內水層，凝膠周圍的水為外水層?？刂平宦?lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結構。交聯(lián)度小的孔徑大，交聯(lián)度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質中小于孔徑的分子進入，大于孔徑的分子被排斥在外水層，Z先被洗脫下來。而進入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區(qū)帶。選擇不同規(guī)格的凝膠，可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。 　　◆親和層析 　　在一對有專一的相互作用的物質中，把其中之一聯(lián)結在支持物上，用于純化相對的另一物質。常見的親和對如：酶和YZ劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。 　　◆氣相層析 　　屬于分配層析或吸附層析，僅適用于分析分離揮發(fā)性和低揮發(fā)性物質。固定相是在惰性支持物（如磨細的耐火磚）上覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和油脂、環(huán)氧類聚合物。外涂層約為支持物重量的20％。分析時操作溫度范圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區(qū)帶十分清晰，是由于揮發(fā)性物質在兩相間能很快達到平衡，所需分析時間大為縮短，一般為數(shù)分鐘至10余分鐘。檢測記錄系統(tǒng)繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點。氣相層析也能用于分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。 　　◆紙層析 　　以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用于分析簡單的混合物時可做單向層析。對于復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁diyi次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創(chuàng)了近代層析的發(fā)展和應用的新局面。70年代以后，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、GX液相層析等所代替。 　　◆薄層層析 　　在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等，根據(jù)需要做不同類型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解于濃甲酸中，涂在滌綸片基上，當甲酸揮發(fā)后，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。 　　◆GX液相層析（又名高壓液相色譜） 　　70年代新發(fā)展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強Z高可達5000psi（相當于34個標準大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1～2微米的二氧化硅，經(jīng)硫酰氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質，兩者互為補充，都是目前Z為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng)，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫(yī)藥學和環(huán)境科學的研究中發(fā)揮了重要作用。 　　◆反相層析 　　在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，Z先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。 　　◆同系層析 　　在核酸分析中，將樣品經(jīng)核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標記后，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過的核苷酸推進，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。于是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用于寡核苷酸的順序分析。 　　紙層析是層析法的一種，要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基于被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達到彼此分離的目的。 　　層析法的Z大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用于少量物質的分析鑒定，又可用于大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用于科學研究與工業(yè)生產上。現(xiàn)在，它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學、環(huán)境科學、農業(yè)科學等領域都發(fā)揮著十分重要的作用。 　　層析根據(jù)固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質的層析。

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