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- 山谷20 2015-04-16 00:00:00
- 從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸將細(xì)胞中含有的胰蛋白酶原提取出來(lái)，然后根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理將提取液的pH值調(diào)至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出來(lái).經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀.沉淀物經(jīng)水溶解并調(diào)至pH8.0，用極少量的胰蛋白酶將胰蛋白酶原激活，同時(shí)溶液中的胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原也被激活，三種酶原相互作用過(guò)程如下： 也可采用從胰臟中提取出胰蛋白酶原，利用合適的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通過(guò)溶液中Ca2+的環(huán)境，使胰蛋白酶原被開(kāi)始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘囊鹊鞍酌福ㄒ饶榈鞍酌冈皬椥缘鞍酌冈嗤瑫r(shí)被胰蛋白酶激活成有活性的酶）. 激活后的酶溶液再進(jìn)一步分離純化. 〔試劑和器材〕 1、試劑 （1）pH2.3.0乙酸化的水溶液 （2）10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸 （3）2mol/L硫酸 （4）固體硫酸銨 （5）無(wú)水CaCl2 （6）結(jié)晶胰蛋白酶 （7）25%乙醇溶液(含0.015mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl2) （8）95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇 （9）5mol/L NaOH （10）丙酮 2、器材 （1）胰臟 （2）組織搗碎機(jī) （3）離心機(jī) （4）磁力攪拌器 （5）透析袋、20目篩網(wǎng)、紗布、水浴鍋 （6）燒杯、量筒、刻度吸管、試管、玻璃漏斗 （7）布氏漏斗、抽濾瓶、溫度計(jì)、滴管、玻璃攪棒、紗布、pH試紙等 〔方法和步驟〕 方法一 1、 胰蛋白酶原的提取 取新鮮胰臟約150g，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重100g，切成碎塊，在組織搗碎機(jī)中搗碎，并加入2倍體積預(yù)冷的pH2.3.0乙酸化水溶液，制成勻漿.漿液倒入500mL燒杯中，用10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸調(diào)節(jié)pH在2.3.0之間，在5～10℃下提取6h以上，并間隙輕輕攪拌.用4層紗布過(guò)濾，盡量擠出濾液.組織殘?jiān)性偌尤?.5倍體積（約50mL左右）預(yù)冷的pH2.3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4層紗布過(guò)濾.合并兩次濾液，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)濾液pH在2.3.0之間，4℃放置4h（pH始終保持在2.3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出.提取液用折疊濾紙于玻璃漏斗中自然過(guò)濾，收集濾液，量取體積（約200mL左右）. 濾液中加入粉末狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492g，5℃）.放置過(guò)夜，使胰蛋白酶原完全析出.次日抽濾，棄濾液，壓緊并收集濾餅，即胰蛋白酶原粗品. 2、 胰蛋白酶原的激活 將胰蛋白酶原粗品稱重（濕重），分次加入10倍體積預(yù)冷的蒸餾水（按濾餅重量計(jì)算），使濾餅完全溶解（一般情況濾餅中硫酸銨含量約占餅重1/4）.用5mol/L NaOH將溶液調(diào)至pH8.0，慢慢地?cái)嚢柘录尤牍腆w無(wú)水CaCl2使溶液的Ca2+終濃度達(dá)到0.1mol/L（要減去一部分氯化鈣與硫酸銨結(jié)合生成硫酸鈣的鈣離子）.取出2mL溶液用于測(cè)定激活前的蛋白含量及酶活性.原溶液中加入5mg結(jié)晶胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化.每隔1h取樣測(cè)定胰蛋白酶活性增長(zhǎng)情況，直至酶激活速度變慢或停止增長(zhǎng).一般比活可達(dá)到3 500～4 000 BAEE單位/mg.留取2mL溶液用于測(cè)定激活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性.激活酶溶液用2mol/L硫酸調(diào)pH至2.3.0，濾紙過(guò)濾，濾去硫酸鈣沉淀，收集濾液，4℃保存?zhèn)溆? 方法二 稱取冷凍豬胰臟100g，在2～5℃下解凍，切成小塊，用組織搗碎機(jī)中絞碎成胰漿，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化.胰漿中加入25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2），搗碎機(jī)中搗碎1min.胰漿倒入500mL燒杯中，間隙攪拌，溫度20℃左右，活化5～6h.每隔1.5h，吸取2mL活化液用于測(cè)定激活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性. 活化反應(yīng)結(jié)束后，胰漿3 500 r/min離心20min，將離心后上清液用二層紗布過(guò)濾.濾液置250mL燒杯中，以過(guò)濾清液的體積為準(zhǔn)，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使溶液硫酸銨飽和度為20%.放置 6h后，3 500 r/min離心20min，保存上清液待用，取沉淀.沉淀分別用適量95%乙醇洗滌過(guò)濾，再用丙酮洗滌，過(guò)濾.Z后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ. 在上述離心上清液中，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使上清液溶液達(dá)到55%硫酸銨飽和度，放置 6h后，3 500 r/min離心30min，取離心沉淀，分別用適量95%乙醇、丙酮洗滌，過(guò)濾后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ.
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- 如何使用EDGE從需要進(jìn)行酸水解的食品樣品中提取脂肪
簡(jiǎn)介
食品制造商需要提取脂肪。 通常，必須使用酸對(duì)食品樣品進(jìn)行預(yù)水解，以便在提取過(guò)程中回收其總脂肪。 例如，在低于正常脂肪提取溫度的情況下，發(fā)生化學(xué)變化的食物（如雞蛋）需要此步驟。使用這個(gè)操作程序從需要預(yù)水解的食 品中，用酸水解的方式提取脂肪，對(duì)于用戶而言，在他們的實(shí)驗(yàn)室中這個(gè)步驟是必須的。
樣品類型
含有結(jié)合脂肪的食物或用戶想要水解的任何食物。 但是請(qǐng)不要使用這種方法從肉類中提取脂肪。
樣品準(zhǔn)備
1. 研磨或均質(zhì)食品樣品。
注意：食物含水多嗎？研磨前，請(qǐng)?jiān)?nbsp;100 °C 的烘箱中預(yù)干燥樣品 1 小時(shí)。
2.稱取 3 g 或更少的食物樣品放入玻璃燒杯中。記錄重量。
注意：對(duì)于堅(jiān)果醬等脂肪較多的食物，請(qǐng)使用較小的樣本量（2 克或更少）。
3. 向樣品中加入 45 mL 沸水。然后，向樣品中添加 55 mL 的 8 M HCl。
4. 用玻璃攪拌棒攪拌混合物，用表面皿蓋住混合物，并使用加熱板或加熱塊使樣品沸騰 1 小時(shí)?；旌衔飼?huì)變 成黑色的變體。
5. 將混合物從火上移開(kāi)，讓它摸起來(lái)冷卻。
6. 使用 Whatman 1 過(guò)濾器組裝過(guò)濾裝置。
注意：過(guò)濾裝置可以是放置在帶有真空的過(guò)濾瓶中的布氏漏斗中的過(guò)濾器，也可以是放置在帶有燒瓶下方的 漏斗中的過(guò)濾器，允許樣品通過(guò)重力滴入。
7. 將樣品轉(zhuǎn)移到過(guò)濾組件中，讓過(guò)濾器收集黑色水解產(chǎn)物。用 100 mL 水沖洗原始樣品燒杯，以轉(zhuǎn)移可能留 在燒杯中的任何水解產(chǎn)物
8. 從過(guò)濾裝置中取出過(guò)濾器。在 100 °C 下烘箱干燥過(guò)濾器 1 小時(shí)。
9. 通過(guò)將 G0 Q-Disc 插入 Q-Cup 的底部，然后在頂部放置 Q-Support 來(lái)準(zhǔn)備 Q-Cup。
注意：EDGE方法編程時(shí)請(qǐng)選擇G0作為EDGE方法中的Q-Disc
10. 將干燥的過(guò)濾器插入 Q-Cup 的頂部。
注意：過(guò)濾器可能會(huì)被撕裂或穿孔，而不會(huì)降低脂肪回收率。如果使用的過(guò)濾器很大，可以將它們撕開(kāi)以 更好地安裝在 Q-Cup 內(nèi)。
11. 在折疊過(guò)濾器的頂部放置一個(gè) Q-Screen，然后使用 Q-Screen 工具將過(guò)濾器壓縮到 Q-Cup 中。
12. 將 Q-Cup 放在 EDGE 架上。將預(yù)先稱重的小瓶與架子上記錄的重量放在一起。
EDGE萃取
13. 通過(guò)用石油醚或所需溶劑灌注溶劑管線并在下面的 EDGE 方法中編程來(lái)準(zhǔn)備 EDGE。
14. 使用下面的 EDGE 方法提取樣品。
注意：此方法需要兩個(gè) 40 mL 或 60 mL 小瓶。
萃取的后續(xù)工作
15. 從架子上取下萃取瓶。
注意：如果樣品的脂肪含量較高，則所得提取物可能呈黃色。
16. 將樣品瓶置于 60 °C 的蒸發(fā)器中，讓所有溶劑蒸發(fā)。
注意：脂肪將作為油性粘稠層保留在小瓶底部。
17. 將樣品瓶放入 100 °C 的烘箱中 1 小時(shí)，以去除任何殘留的水分或溶劑。
18. 讓小瓶冷卻并稱重。
其中小瓶之后是蒸發(fā)后小瓶的重量，小瓶之前是提取前小瓶的重量。
方法開(kāi)發(fā)技巧
以下方法是適用于大多數(shù)樣品類型的保守方法。請(qǐng)注意，可能有針對(duì)特定樣品的更優(yōu)化方法。請(qǐng)聯(lián)系 Molecular Support以獲取更多信息。
文獻(xiàn)中有許多可用的酸水解方法。任何方法都可以，只要將黑色水解產(chǎn)物過(guò)濾，用水徹底沖洗，并用可干燥 和提取的過(guò)濾器捕獲即可。
其他提取溶劑，如乙酉迷和己烷，可用于提取脂肪。
如果此方法的回收率低于預(yù)期，則將每個(gè)循環(huán)的保持時(shí)間增加 1 分鐘。此外，如果可能，請(qǐng)考慮增加總提 取量或減少樣本量。
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