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  WkJCINKZSL 2009-02-27 00:00:00

  紫外誘變和微波誘變是較常用的物理誘變方法， 它們操作簡單，對設(shè)備要求不高，不需要昂貴的設(shè)備， 比較適合基層單位進行誘變育種。本文就這兩種方法 對不同多不飽和脂肪酸誘變效果進行比較研究，為采 用這兩種方法進行產(chǎn)油菌株誘變育種提供一些依據(jù) 1 試驗材料與方法 1．1 實驗材料 1．1．1 菌株 本實驗室分離并保存。 FR3，刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)； AGEDm59、AGEDm 95為菌株AGED激光誘變 株，多形單毛孢(Monoblepharispolymorpha Comu)。 其中FR37-~][麻酸含量、AGEDm59花生四稀酸含 量、AGEDm 95二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量 較高。 1．1．2 實驗儀器 超凈工作臺、格蘭氏微波爐、索氏抽提器、粉碎機、電子天平； 氣相色譜儀：福立9790氣相色譜儀，CT-IA氮、 氫、空氣發(fā)生器(武漢科林分析技術(shù)研究所)，GPI一2 氣體凈化器(福立儀器)。 1．1．3 試驗試劑 、石油醚、苯、甲醇、氫氧化鉀； GLA 甲脂、AA甲脂、EPA甲脂及DHA 甲脂標(biāo)準(zhǔn) 品購白Sigma公司，其他試劑均為分析純。 1．1．4 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基；種子和發(fā)酵培養(yǎng)基 為PDY液體培養(yǎng)基。 1．2 試驗方法 1．2．1 孢子懸液的制備 FR3取7天種齡、AGEDm59、AGEDm 95取l0 天種齡的斜面菌株，用無菌水洗下孢子(并用接種針輕 刮表面)，F(xiàn)R3配成10一、AGEDm59、AGEDm 95配 成l0。濃度的孢子液。 1．2．2 誘變及保種 紫外誘變：先打開紫外燈照射30min，取0．5ml孢 子懸液到倒好DPA固體培養(yǎng)基的平皿中，涂布均勻， 放在紫外燈下(紫外燈為25W，照射距離為35cm) 照射，之后置于25℃避光24h培養(yǎng)。隨機挑取單菌落 于斜面中保存。 微波誘變：由于微波照射會產(chǎn)生熱效應(yīng)，因此在進 行微波誘變時采用了間歇性照射【6】，即先照射一段時 間后進行冷卻，再照射，照射時間為各次照射時間的 累加。250mi三角瓶裝100ml經(jīng)過活化的孢子懸液(即 先在150r／min的搖床上振蕩5h)【7】，用中等強度功率 照射，每次照射的時間為l0秒，隨機挑取的誘變株都 保存于斜面中。 1．2．3 菌絲培養(yǎng)和收獲 把長好的誘變株從斜面轉(zhuǎn)到500ml三角瓶中(內(nèi) 裝200mlPDY液體培養(yǎng)基)，置于25℃ 中l(wèi)50轉(zhuǎn)／分鐘 搖床上培養(yǎng)。FR3培養(yǎng)4天，AGEDm59、AGEDm 95 培養(yǎng)6天后下樣，用濾布過濾獲得濕菌絲體。將所得 濕菌絲體在36℃烘箱內(nèi)烘干，稱重，計算生物量； 1．2．4 油脂提取及甲脂化 將干菌體粉碎，并用脫脂濾紙包好，用100ml乙 醚在43~C進行索氏提取6h，回收溶劑，用N2吹走殘 留溶劑稱重，計算粗油脂量。油脂甲脂化的方法見參考 文獻 1．2．5 氣相色譜分析條件 色譜柱：FFAP交聯(lián)石英毛細管柱(0．25mmx 0．25 pmx30m)；檢測器：氫火焰檢測器(FID)；載氣：N2(流量60 mLlmin)：溫度：進樣器溫度160℃ ，檢測器溫 度240℃；柱溫：160℃升至200℃ (8℃／rnin)，繼續(xù)升 至220℃ (2℃／min)，恒溫7min，降至160℃ 。 1．2．6 多不飽和脂肪酸含量分析 用微量進樣器吸取l 上層清液進樣分析，對照 標(biāo)準(zhǔn)品保留時間進行定性，由面積歸一化法確定相對 百分含量。 2 結(jié)果與分析 紫外誘變中不同致死率對誘變的效果影響較大， 據(jù)報道，在致死率為75～80％之間誘變的效果Z好I9J， 3株菌株從致死率為75～80％的照射劑量中共獲得105 株紫外誘變株，其中F 為2l株，AGEDm59為58 株， AGEDm95為26株。 微波誘變中致死率對誘變效果的影響不同的研究 有不同的結(jié)果，本實驗采用的致死率為40~60％【l0】， 從3株菌中共獲得78株微波誘變株，其中FR3為27 株，AGEDm59為25株， AGEDm95為26株。 2．1 生物量 從表l的生物量看，AGED系列2株菌紫外誘變 的正誘變率遠高于微波誘變，對菌株FR3而言微波誘 變正誘變率略高于紫外誘變。從生物量的平均提高率 和Z大提高率上也得到同樣的結(jié)果，但提高的幅度不 大，只有菌株FR3微波誘變的Z大提高率和AGEDm59 紫外誘變的Z大提高率超過10％，分別達到10．29％ 和l3．87％ 。 從結(jié)果分析來看，兩種誘變方法均不能大幅度提 高生物量。 2．2 油脂產(chǎn)量 從表2可看出，在油脂產(chǎn)量正誘變率、平均提高 率和Z大提高率上微波誘變比紫外誘變有顯著提高。 除了AGEDm59兩種誘變效果比較接近外，其它的兩 株菌的平均提高率和Z大提高率微波誘變比紫外誘變 幾乎提高2倍以上，而且微波誘變的Z大提高率比較 穩(wěn)定，都在20％左右。 從結(jié)果分析來看，采用微波誘變來提高油脂產(chǎn)量 可以取得較好的效果。

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