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  tg894950849 2017-03-29 00:00:00

  用紫外光光度測定蛋白質(zhì)含量 引用： 6種測定蛋白質(zhì)含量 、微量凱氏（kjeldahl）定氮 品與濃硫酸共熱含氮機(jī)物即解產(chǎn)氨（消化）氨與硫酸作用變硫酸氨經(jīng)強堿堿化使解放氨借蒸汽氨蒸至酸液根據(jù)酸液程度計算品氮含量若甘氨酸例其反應(yīng)式： nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反應(yīng)（1）、(2)凱氏瓶內(nèi)完反應(yīng)（3）凱氏蒸餾裝置進(jìn)行 加速消化加入cuso4作催化劑k2so4提高溶液沸點收集氨用硼酸溶液滴定則用強酸實驗計算略 計算所結(jié)品總氮量欲求 品蛋白含量應(yīng)總氮量減非蛋白 氮即欲進(jìn)步求品蛋白質(zhì)含量即用品蛋白氮乘6．25即 二、雙縮脲（biuret） （）實驗原理 雙縮脲（nh3conhconh3）兩脲經(jīng)180℃左右加熱放氨產(chǎn)物強堿性溶液雙縮脲與cuso4形紫色絡(luò)合物稱雙縮脲反應(yīng)凡具兩酰胺基或兩直接連接肽鍵或能間碳原相連肽鍵類化合物都雙縮脲反應(yīng) 紫色絡(luò)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度比與蛋白質(zhì)量及氨基酸關(guān)故用測定蛋白質(zhì)含量測定范圍1-10mg蛋白質(zhì)干擾測定物質(zhì)主要：硫酸銨、tris緩沖液某些氨基酸等 優(yōu)點較快速 同蛋白質(zhì)產(chǎn)顏色深淺相近及干擾物質(zhì)少主要缺點靈敏度差雙縮脲用于需要快速并需要十精確蛋白質(zhì)測定 （二）試劑與器材 1. 試劑： （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白配制10mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液用bsa濃度1mg/mla2800.66校其純度需要標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)預(yù)先用微量凱氏定氮測定蛋白氮含量計算其純度再根據(jù)其純度稱量配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制酪蛋白用0．05n naoh配制 （2）雙縮脲試劑：稱1.50克硫酸銅（cuso4?5h2o）6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6?4h2o）用500毫升水溶解攪拌加入300毫升10% naoh溶液用水稀釋1升貯存于塑料瓶（或內(nèi)壁涂石蠟瓶）試劑期保存若貯存瓶黑色沉淀現(xiàn)則需要重新配制 2. 器材： 見光光光度計、試管15支、旋渦混合器等 （三）操作 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：取12支試管兩組別加入00.20.40.60.81.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用水補足1毫升加入4毫升雙縮脲試劑充搖勻室溫（20～25℃）放置30鐘于540nm處進(jìn)行比色測定用未加蛋白質(zhì)溶液第支試管作空白照液取兩組測定平均值蛋白質(zhì)含量橫座標(biāo)光吸收值縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 2、品測定：取2～3試管用述同測定未知品蛋白質(zhì)濃度注意品濃度要超10mg/ml 三、folin—酚試劑（lowry） （）實驗原理 種蛋白質(zhì)測定靈敏應(yīng)用廣泛種由于其試劑乙配制較困難（現(xiàn)已訂購）近逐漸考馬斯亮蘭所取代顯色原理與雙縮脲相同加入第二種試劑即folin—酚試劑增加顯色量提高檢測蛋白質(zhì)靈敏度兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)深蘭色原：堿性條件蛋白質(zhì)肽鍵與銅結(jié)合復(fù)合物folin—酚試劑磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽蛋白質(zhì)酪氨酸苯丙氨酸殘基原產(chǎn)深蘭色（鉬蘭鎢蘭混合物）定條件蘭色深度與蛋白量比 folin—酚試劑早由lowry確定蛋白質(zhì)濃度測定基本步驟物化領(lǐng)域廣泛應(yīng)用測定優(yōu)點靈敏度高比雙縮脲靈敏缺點費間較要精確控制操作間標(biāo)準(zhǔn)曲線嚴(yán)格直線形式且專性較差干擾物質(zhì)較雙縮脲反應(yīng)發(fā)干擾離同容易干擾lowry反應(yīng)且者影響要酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均干擾作用濃度較低尿素（0.5%）硫酸納（1%）硝酸納（1%）三（0.5%）乙醇（5%）（5%）丙酮（0.5%）等溶液顯色影響些物質(zhì)濃度高必須作校曲線含硫酸銨溶液須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液即顯色測定若品酸度較高顯淺則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液濃度1～2倍 進(jìn)行測定加folin—酚試劑要特別該試劑僅酸性ph條件穩(wěn)定述原反應(yīng)ph=10情況發(fā)故folin酚試劑加堿性銅—蛋白質(zhì)溶液必須立即混勻便磷鉬酸—磷鎢酸試劑破壞前原反應(yīng)即能發(fā) 適用于酪氨酸色氨酸定量測定 檢測低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg通測定范圍20~250mg （二）試劑與器材 1.試劑 （1）試劑甲： （a）10克 na2co32克 naoh0.25克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6?4h2o）溶解于500毫升蒸餾水 （b）0.5克硫酸銅（cuso4?5h2o）溶解于100毫升蒸餾水每使用前50份（a）與1份（b）混合即試劑甲 （2）試劑乙：2升磨口流瓶加入100克鎢酸鈉（na2wo4?2h2o），25克鉬酸鈉（na2moo4?2h2o）及700毫升蒸餾水再加50毫升85%磷酸100毫升濃鹽酸充混合接流管火流10流結(jié)束加入150克硫 酸 鋰（li2so4）50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴口繼續(xù)沸騰15鐘便驅(qū)除量溴冷卻溶液呈黃色（仍呈綠色須再重復(fù)滴加液體溴步驟）稀釋至1升濾濾液置于棕色試劑瓶保存使用用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定酚酞作指示劑適稀釋約加水1倍使終酸濃度1n左右 （3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液: 精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白溶于蒸餾水濃度250mg/ml左右牛血清清蛋白溶于水若混濁改用0.9%nacl溶液 2. 器材 （1）見光光光度計 （2）旋渦混合器 （3）秒表 （4）試管16支 （三）操作 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：取16支試管1支作空白3支留作未知品其余試管兩組別加入00.10.20.40.60.81.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度250mg/ml）用水補足1.0毫升每支試管加入5毫升試劑甲旋渦混合器迅速混合于室溫（20～25℃）放置10鐘再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑）同立即混勻步混合速度要快否則使顯色程度減弱室溫放置30鐘未加蛋白質(zhì)溶液第支試管作空白照于700nm處測定各管溶液吸光度值蛋白質(zhì)量橫座標(biāo)吸光度值縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 注意：lowry反應(yīng)顯色隨間斷加深各項操作必須精確控制間即第1支試管加入5毫升試劑甲始計1鐘第2支試管加入5毫升試劑甲2鐘加第3支試管余類推全部試管加完試劑甲若已超10鐘則第1支試管立即加入0.5毫升試劑乙1鐘第2支試管加入0.5毫升試劑乙2鐘加第3支試管余類推待支試管加完試劑再放置30鐘始測定光吸收每鐘測品 進(jìn)行試管操作防止錯每位都必須實驗記錄本預(yù)先畫面表格表每試管要加入量（毫升）并按由左至右由至順序逐管加入面兩排計算每管蛋白質(zhì)量（微克）測吸光度值 folin—酚試劑實驗表 管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白質(zhì) 0.2 0.4 0.6 （約250mg/ml） 蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管蛋白質(zhì)量（mg） 吸光度值（a700） 2. 品測定：取1毫升品溶液（其約含蛋白質(zhì)20~250微克）按述進(jìn)行操作取1毫升蒸餾水代替品作空白照通品測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定放起同進(jìn)行即標(biāo)準(zhǔn)曲線測定各試管面再增加3試管表8、9、10試管 根據(jù)所測品吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線查相應(yīng)蛋白質(zhì)量計算品溶液蛋白質(zhì)濃度 注意:由于各種蛋白質(zhì)含同量酪氨酸苯丙氨酸顯色深淺往往隨同蛋白質(zhì)變化本測定通適用于測定蛋白質(zhì)相濃度（相于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)） 四、改良簡易folin—酚試劑 （）試劑 1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸鉀0.05%硫酸銅配制注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解加入2. 試劑乙：與前面基本相同臨用加蒸餾水稀釋8倍 3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本 （二）操作步驟 測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與品溶液操作與基本相同試劑甲改1毫升室溫放置10鐘試劑乙改4毫升55℃恒溫水浴保溫5鐘用流水冷卻660nm測定其吸光度值 改良快速簡易獲與 folin—酚試劑（即lowry基本）相接近結(jié) 五、考馬斯亮蘭（bradford） （）實驗原理 雙縮脲（biuret）folin—酚試劑（lowry）明顯缺點許限制促使科家尋找更蛋白質(zhì)溶液測定 1976由bradford建立考馬斯亮蘭（bradford）根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合原理設(shè)計種蛋白質(zhì)測定具超其幾種突優(yōu)點廣泛應(yīng)用目前靈敏度高蛋白質(zhì)測定 考馬斯亮蘭g-250染料酸性溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合使染料吸收峰位置（lmax）由465nm變595nm溶液顏色由棕黑色變蘭色經(jīng)研究認(rèn)染料主要與蛋白質(zhì)堿性氨基酸（特別精氨酸）芳香族氨基酸殘基相結(jié)合 595nm測定吸光度值a595與蛋白質(zhì)濃度比 bradford突優(yōu)點： （1）靈敏度高據(jù)估計比lowry約高四倍其低蛋白質(zhì)檢測量達(dá)1mg蛋白質(zhì)與染料結(jié)合產(chǎn)顏色變化蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物更高消光系數(shù)光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度變化比lowry要 （2）測定快速、簡便需加種試劑完品測定需要5鐘左右由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合程約要2鐘即完其顏色1內(nèi)保持穩(wěn)定且5鐘至20鐘間顏色穩(wěn)定性完全用像lowry費嚴(yán)格控制間 （3）干擾物質(zhì)少干擾lowryk+、na+、mg2+離、tris緩沖液、糖蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均干擾測定 缺點： （1）由于各種蛋白質(zhì)精氨酸芳香族氨基酸含量同bradford用于同蛋白質(zhì)測定較偏差制作標(biāo)準(zhǔn)曲線通選用 g—球蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)減少面偏差 （2）仍些物質(zhì)干擾測定主要干擾物質(zhì)：污劑、 triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）0.1nnaoh（同0.1n酸干擾lowary） （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線輕微非線性能用beer定律進(jìn)行計算能用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定未知蛋白質(zhì)濃度 （二）試劑與器材 1. 試劑： （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)配制1.0mg/ml0.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 （2）考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250溶于50ml 95%乙醇再加入120ml 85%磷酸用水稀釋至1升 2. 器材： （1）見光光光度計 （2）旋渦混合器 （3）試管16支 （三）操作 1. 標(biāo)準(zhǔn) （1）取16支試管1支作空白3支留作未知品其余試管兩組按表順序別加入品、水試劑即用1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml用離水補充0.1ml各試管別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑每加完管立即旋渦混合器混合（注意要太劇烈免產(chǎn)量氣泡難于消除）未知品加量見表第8、9、10管 （2）加完試劑2-5鐘即始用比色皿光光度計測定各品595nm處光吸收值a595空白照第1號試管即0.1mlh2o加5.0mlg—250試劑 注意：使用石英比色皿（易洗染色）用塑料或玻璃比色皿使用立即用少量95%乙醇蕩洗洗染色塑料比色皿決用乙醇或丙酮間浸泡 考馬斯亮蘭實驗表 管 號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白質(zhì) 0.02 0.04 0.06 (約1.0mg/ml) 蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考馬斯亮藍(lán) g－250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管蛋 白質(zhì)量（mg） 光吸收值 （a595） （3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）橫座標(biāo)用吸光度值a595縱座標(biāo)作圖即條標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)測未知品a595值即查未知品蛋白質(zhì)含量 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液a595約0.50 2. 微量 品蛋白質(zhì)濃度較?。?0－100mg/ml），取量（包括補加水）加0.5ml或1.0ml， 空白照則別0.5ml或1.0ml h2o， 考馬斯亮藍(lán)g－250試劑仍加5.0ml， 同作相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定595nm光吸收值 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液a595約0.29 六、紫外吸收 蛋白質(zhì)酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸殘基苯環(huán)含共軛雙鍵使蛋白質(zhì)具吸收紫外光性質(zhì)吸收高峰280nm處其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量比外蛋白質(zhì)溶液238nm光吸收值與肽鍵含量比利用定波蛋白質(zhì)溶液光吸收值與蛋白質(zhì)濃度比關(guān)系進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定 紫外吸收簡便、靈敏、快速消耗品測定仍能收使用低濃度鹽例化制備用（nh4）2so4等數(shù)緩沖液干擾測定特別適用于柱層析洗脫液快速連續(xù)檢測需測定蛋白質(zhì)濃度變化需知道其絕值 特點測定蛋白質(zhì)含量準(zhǔn)確度較差干擾物質(zhì)用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白質(zhì)含量些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酪氨酸色氨酸含量差異蛋白質(zhì)定誤差故該適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組相似蛋白質(zhì)若品含嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光物質(zhì)現(xiàn)較干擾核酸干擾通查校表再進(jìn)行計算加適校同蛋白質(zhì)核酸紫外吸收相同雖經(jīng)校測定結(jié)存定誤差 外進(jìn)行紫外吸收測定由于蛋白質(zhì)吸收高峰ph改變變化要注意溶液ph值測定品ph要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線ph相致 面介紹四種紫外吸收： 1. 280nm光吸收 蛋白質(zhì)酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸280nm處具吸收且各種蛋白質(zhì)三種氨基酸含量差別測定蛋白質(zhì)溶液280nm處吸光度值用紫外吸收 測定待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿用配制蛋白質(zhì)溶液溶劑（水或緩沖液）作空白照紫外光度計直接讀取280nm吸光度值a280蛋白質(zhì)濃度控制0.1～1.0mg/ml左右通用1cm光徑標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿盛濃度1mg/ml蛋白質(zhì)溶液a280約1.0左右由立即計算蛋白質(zhì)致濃度 許蛋白質(zhì)定濃度定波光吸收值（a1％1cm）文獻(xiàn)數(shù)據(jù)查根據(jù)光吸收值較準(zhǔn)確計算蛋白質(zhì)濃度式列蛋白質(zhì)濃度與（a1％1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度1%光徑1cm光吸收值）關(guān)系文獻(xiàn)值a1％1cm，?稱百吸收系數(shù)或比吸收系數(shù) 蛋白質(zhì)濃度 = (a280′10 )/ a1％1cm，280nm (mg/ml) (q 1%濃度?10mg/ml) 例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ： a1％1cm=22.8 (280nm) 若查待測蛋白質(zhì)a1％1cm值則選用種與待測蛋白質(zhì)酪氨酸色氨酸含量相近蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制濃度1.0mg/ml用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)牛血清清蛋白（bsa） 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：取6支試管按表編號并加入試劑： 管號 1 2 3 4 5 6 bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 a280 用第1管空白照各管溶液混勻紫外光光度計測定吸光度a280a280縱座標(biāo)各管蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）橫座標(biāo)作圖標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)直線利用標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)測未知品a280值即查未知品蛋白質(zhì)含量用2至6管a280值與相應(yīng)試管蛋白質(zhì)濃度計算該蛋白質(zhì)a1％1cm，280nm 2. 280nm260nm吸收差 核酸紫外光強吸收280nm處吸收比蛋白質(zhì)強10倍（每克）核酸260nm處吸收更強其吸收高峰260nm附近核酸260nm處消光系數(shù)280nm處2倍蛋白質(zhì)則相反280nm紫外吸收值于260nm吸收值通： 純蛋白質(zhì)光吸收比值：a280/a260 ? 1.8 純核酸光吸收比值： a280/a260 ? 0.5 含核酸蛋白質(zhì)溶液別測定其a280a260由吸收差值用面經(jīng)驗公式即算蛋白質(zhì)濃度 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260 經(jīng)驗公式通系列已知同濃度比例蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）核酸（酵母核酸）混合液所測定數(shù)據(jù)建立 3. 215nm與225nm吸收差 蛋白質(zhì)稀溶液由于含量低能使用280nm光吸收測定用215nm與225nm吸收值差通標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白質(zhì)稀溶液濃度 用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制20～100 mg/ml系列5.0ml蛋白質(zhì)溶液別測定215nm225nm吸光度值并計算吸收差： 吸收差d= a215 －a225 吸收差d縱座標(biāo)蛋白質(zhì)濃度橫座標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線再測未知品吸收差即由標(biāo)準(zhǔn)曲線查未知品蛋白質(zhì)濃度 本蛋白質(zhì)濃度20~100mg/ml范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與吸光度比nacl、（nh4）2so4及0.1m磷酸、硼酸t(yī)ris等緩沖液都顯著干擾作用0.1n naoh， 0.1m乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、等緩沖液215nm光吸收值較必須其濃度降0.005m才顯著影響 4. 肽鍵測定 蛋白質(zhì)溶液238nm處光吸收強弱與肽鍵少比用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制系列50～500mg/ml已知濃度5.0ml蛋白質(zhì)溶液測定238nm光吸收值a238a238縱座標(biāo)， 蛋白質(zhì)含量橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線未知品濃度即由標(biāo)準(zhǔn)曲線求 進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液柱層析離洗脫液用238nm檢測蛋白質(zhì)峰位 本比280nm吸收靈敏種機(jī)物醇、酮、醛、醚、機(jī)酸、酰胺類氧化物等都干擾作用所用機(jī)鹽機(jī)堿水溶液進(jìn)行測定若含機(jī)溶劑先品蒸干或用其除干擾物質(zhì)用水、稀酸稀堿溶解再作測定 感覺這樣的提問沒有什么意義 不要多想，想多了累

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