摘要

?微波增強的多肽固相合成（SPPS）能夠快速有效地進行大體積氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常規(guī)困難偶聯(lián)

? ?；d體蛋白衍生物VQAibAibIDYINGOH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小時內完成，純度分別為95%和86%

? GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2的合成在3小時內完成，純度為 89%

介紹

在許多生物學相關的化合物中都可以找到受阻的非標準氨基酸，例如α-氨基異丁酸(Aib)和N-甲基丙氨酸((N-Me)-A)（圖1）1-3。然而，包括Aib或N-甲基化氨基酸的肽合成已被證明具有挑戰(zhàn)性；第二個甲基引入的空間位阻，無論是在α-碳還是酰胺氮上，都使這些氨基酸衍生物在傳統(tǒng)SPPS中難以偶聯(lián)。

圖1 位阻、非標準氨基酸

然而，通過使用微波增強的SPPS，與受阻非標準氨基酸相關的困難已被最小化。在SPPS中使用微波能量可以快速有效地完成大體積氨基酸（如Aib和N-甲基丙氨酸）的常規(guī)困難偶聯(lián)4,5。

材料和方法

試劑

N-α-Fmoc-α-氨基異丁酸獲自AnaSpec(Freemont,CA)。Fmoc-N-Me-Ala-OH獲自Peptides International(Louisville,KY)。所有其他氨基酸均獲自CEM Corporation(Matthews,NC)，并含有以下側鏈保護基團：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(OtBu) 和Tyr(tBu) 。Oxyma Pure和Rink Amide ProTideTM LL樹脂購自CEM Corporation(Matthews,NC)。N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)獲自CreoSalus(Louisville,KY)。Fmoc-Gly-Wang Resin LL購自NovaBiochem(St.Louis,MO)。哌啶獲自Alfa Aesar(Ward Hill,MA)。三氟乙酸(TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol(DODT)、三異丙基硅烷(TIS)和乙酸購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和無水乙 醚(Et2O)購自VWR (West Chester,PA)。HPLC級水(H2O)和HPLC級 乙 腈(MeCN) 購 自 Fisher Scientific (Waltham, MA) 。

多肽合成：GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEM Liberty Blue?自動微波肽合成儀在Rink Amide ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.18meq/g）上以0.1mmol規(guī)模制備多肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯(lián)反應。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，肽在無水乙 醚中沉淀并凍干過夜。

多肽合成：VQAibAibIDYING-OH

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在FmocGly-Wang LL 樹脂（離子交換容量：0.33meq/g）上以0.1mmol規(guī)模制備。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯(lián)反應。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，肽在無水乙 醚中沉淀并凍干過夜。

多肽合成：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在FmocGly-Wang LL 樹脂（離子交換容量：0.19meq/g）上以0.1mmol規(guī)模制備肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯(lián)反應。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，肽在無水乙 醚中沉淀并凍干過夜。

多肽分析

在配備有PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上分析肽，該檢測器配備Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS用于結構測定。在Waters MassLynx軟件上進行峰分析。使用(i)H2O和(ii)MeCN中的0.1%TFA梯度洗脫進行分離。

結果

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增強SPPS產生了89%純度的目標肽（圖2）。

圖2.GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的HPLC色譜圖

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上的VQAibAibIDYING-OH的微波增強SPPS產生了純度為95% 的目標肽（圖3）。

圖 3：VQAibAibIDYING-OH的HPLC色譜圖

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上的VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的微波增強SPPS產生了純度為86%的目標肽（圖4）。

圖 4：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的HPLC色譜圖

結論

微波增強的SPPS能夠快速有效的進行大體積氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常規(guī)困難偶聯(lián)。常規(guī)合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2需要40小時且純度< 10%，但微波增強SPPS在3小時內產生目標肽且純度為89%。此外，酰基載體蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小時內完成，純度分別為95% 和86%。微波增強的SPPS已被證明是一種有效的工具，可以最 大限度地減少SPPS中受阻的非標準氨基酸相關的困難。

參考文獻

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2. Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B. J. Pept. Sci. 2000, 6, 519–533.

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4. Collins, J. M. Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics. In Microwaves in Organic Synthesis, Third Edition; de la Hoz, A.; Loupy, A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012; 897–959.

5. Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N. Org. Lett. 2014, 16 (6), 1783–1785.

摘要

40多年來，CEM一直是食品分析的先驅，與大大小小的公司合作，開發(fā)更好的工藝以提高產品質量。在這個應用說明中，我們展示了直接分析加工肉類產品的好處，這些產品通常含有混合成分，并不總是符合傳統(tǒng)測試方法。擁有正確的水分、脂肪和蛋白質分析水平可以轉化為安全、有利和持久的高質量產品。

簡介

加工肉制品，如香腸、臘腸和肉干，由于產品的非均質性，通常含有草藥、香料、防腐劑和其他非肉類成分，導致難以分析。傳統(tǒng)的濕化學分析，如化學脂肪提取或凱氏消解法分析蛋白質，都很昂貴。消解法進行蛋白質分析，既昂貴又耗時，而且需要使用危險化學品。濕化學方法經常被非肉類添加劑所影響，導致不準確的結果和隨后的配方錯誤。近紅外光譜法（NIR）是一種快速替代濕化學方法的檢測方法。近紅外光譜法是濕化學方法的快速替代方法，在不到一分鐘的時間內提供結果，而且不會使用危險化學品。然而，近紅外和傅立葉紅外等光學方法需要非常高的樣品均勻度，并且必須根據配方中使用的添加劑的數(shù)量進行校準。顏色、濃度或配方的變化會對結果產生負面影響，從而使獲得準確的結果變得很困難。

SMART 6?和ORACLE?系統(tǒng)的結合提供了快速的水分和脂肪測定，其結果在5分鐘內完成。SMART 6水分和固體分析儀利用雙頻能量，在3分鐘或更短時間內快速分析任何產品，無論是濕的還是干的，都能在3分鐘或更短時間內完成。ORACLE通過完全隔離脂肪分子的信號，消除了對方法開發(fā)的需要。即使在復雜的樣品基質中，也能完全隔離脂肪分子的信號。

Sprint?是一個直接的蛋白質測量系統(tǒng)，它利用染料結合技術確保只檢測真正的蛋白質。而不是總氮，因為總氮在非蛋白氮存在的情況下會導致錯誤的測量。Sprint不需要定期校準，而且任何實驗室用戶都可以很容易的創(chuàng)建方法。與之相競爭的快速技術（近紅外、FT-IR、TDNMR）由于顏色、質地和濃度的變化，每個獨特的樣品都需要持續(xù)的、昂貴的校準和方法開發(fā)。這項研究表明，CEM的創(chuàng)新技術可以快速分析各種加工肉類的水分、脂肪和蛋白質，其準確性和精確度與參考方法相當。

實驗

為了評估SMART 6、ORACLE和Sprint的性能，我們獲得了五種加工肉類產品：熱狗、奶酪香腸、香腸、半干香腸、牛肉棒和火雞棒。為了測定水分，每個產品中取2克在SMART 6中進行了分析。參考測試在烘箱中進行，一式三份，以建立一個比較的基礎。烘箱法被設定為在100°C下8小時，然后在干燥狀態(tài)下冷卻一段時間，以確保完全干燥。為了進行脂肪分析，將干燥后的樣品從SMART 6中取出，放在ORACLE中，掃描30秒。測試前無需校準或方法開發(fā)。脂肪參考測試是使用索氏提取法進行的。對于蛋白質分析，將1克樣品稱量到Sprint樣品杯中，然后放入Sprint裝置中。染料結合反應是完全自動化的，大約需要4分鐘完成。蛋白質的結果與凱氏消解法進行了比較。

結果

使用CEM的快速技術，水分、脂肪和蛋白質的平均結果與參考結果相比非常接近，如表1、2和3所示。

表1.SMART 6和烘箱之間的水分含量比較

表2.ORACLE和參考化學之間的脂肪含量比較

表3.Sprint和凱氏消解法之間的蛋白質含量比較

結論

對于加工肉類產品，正確的水分、脂肪和蛋白質水平對產品質量和生產可行性至關重要。對于那些要求高質量和高性能的加工肉制品，CEM提供了快速的測試方案，其結果與參考方法一致。與CEM的專 利技術相結合，轉化為市場上最快、最準確的食品成分測試。SMART 6、ORACLE和Sprint分析儀節(jié)省了時間，結果準確，以最 低成本的方案幫助您節(jié)省資金。