摘要

?微波增強的多肽固相合成（SPPS）能夠快速有效地進行大體積氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常規(guī)困難偶聯(lián)

? ?；d體蛋白衍生物VQAibAibIDYINGOH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小時內(nèi)完成，純度分別為95%和86%

? GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2的合成在3小時內(nèi)完成，純度為 89%

介紹

在許多生物學相關(guān)的化合物中都可以找到受阻的非標準氨基酸，例如α-氨基異丁酸(Aib)和N-甲基丙氨酸((N-Me)-A)（圖1）1-3。然而，包括Aib或N-甲基化氨基酸的肽合成已被證明具有挑戰(zhàn)性；第二個甲基引入的空間位阻，無論是在α-碳還是酰胺氮上，都使這些氨基酸衍生物在傳統(tǒng)SPPS中難以偶聯(lián)。

圖1 位阻、非標準氨基酸

然而，通過使用微波增強的SPPS，與受阻非標準氨基酸相關(guān)的困難已被最小化。在SPPS中使用微波能量可以快速有效地完成大體積氨基酸（如Aib和N-甲基丙氨酸）的常規(guī)困難偶聯(lián)4,5。

材料和方法

試劑

N-α-Fmoc-α-氨基異丁酸獲自AnaSpec(Freemont,CA)。Fmoc-N-Me-Ala-OH獲自Peptides International(Louisville,KY)。所有其他氨基酸均獲自CEM Corporation(Matthews,NC)，并含有以下側(cè)鏈保護基團：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(OtBu) 和Tyr(tBu) 。Oxyma Pure和Rink Amide ProTideTM LL樹脂購自CEM Corporation(Matthews,NC)。N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)獲自CreoSalus(Louisville,KY)。Fmoc-Gly-Wang Resin LL購自NovaBiochem(St.Louis,MO)。哌啶獲自Alfa Aesar(Ward Hill,MA)。三氟乙酸(TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol(DODT)、三異丙基硅烷(TIS)和乙酸購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和無水乙 醚(Et2O)購自VWR (West Chester,PA)。HPLC級水(H2O)和HPLC級 乙 腈(MeCN) 購 自 Fisher Scientific (Waltham, MA) 。

多肽合成：GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEM Liberty Blue?自動微波肽合成儀在Rink Amide ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.18meq/g）上以0.1mmol規(guī)模制備多肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯(lián)反應。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，肽在無水乙 醚中沉淀并凍干過夜。

多肽合成：VQAibAibIDYING-OH

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在FmocGly-Wang LL 樹脂（離子交換容量：0.33meq/g）上以0.1mmol規(guī)模制備。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯(lián)反應。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，肽在無水乙 醚中沉淀并凍干過夜。

多肽合成：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在FmocGly-Wang LL 樹脂（離子交換容量：0.19meq/g）上以0.1mmol規(guī)模制備肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯(lián)反應。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，肽在無水乙 醚中沉淀并凍干過夜。

多肽分析

在配備有PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上分析肽，該檢測器配備Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS用于結(jié)構(gòu)測定。在Waters MassLynx軟件上進行峰分析。使用(i)H2O和(ii)MeCN中的0.1%TFA梯度洗脫進行分離。

結(jié)果

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增強SPPS產(chǎn)生了89%純度的目標肽（圖2）。

圖2.GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的HPLC色譜圖

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上的VQAibAibIDYING-OH的微波增強SPPS產(chǎn)生了純度為95% 的目標肽（圖3）。

圖 3：VQAibAibIDYING-OH的HPLC色譜圖

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上的VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的微波增強SPPS產(chǎn)生了純度為86%的目標肽（圖4）。

圖 4：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的HPLC色譜圖

結(jié)論

微波增強的SPPS能夠快速有效的進行大體積氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常規(guī)困難偶聯(lián)。常規(guī)合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2需要40小時且純度< 10%，但微波增強SPPS在3小時內(nèi)產(chǎn)生目標肽且純度為89%。此外，酰基載體蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小時內(nèi)完成，純度分別為95% 和86%。微波增強的SPPS已被證明是一種有效的工具，可以最 大限度地減少SPPS中受阻的非標準氨基酸相關(guān)的困難。

參考文獻

1. Mueller, P.; Rudin, D. O. Nature. 1968, 217, 713–719.

2. Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B. J. Pept. Sci. 2000, 6, 519–533.

3. Ahmed, G.; Elger, W.; Meece, F.; Nair, H. B.; Schneider, B.; Wyrwa, R.; Nickisch, K. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 5569–5575. 

4. Collins, J. M. Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics. In Microwaves in Organic Synthesis, Third Edition; de la Hoz, A.; Loupy, A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012; 897–959.

5. Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N. Org. Lett. 2014, 16 (6), 1783–1785.