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  aaaaa44444a4 2010-12-21 00:00:00

  實驗準(zhǔn)備工作： 1 所用離心管、槍頭要洗凈、烘干（Z好滅菌）。 2 試劑配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 稱取Tris-Base 121g， 加入約800 ml 水在磁力攪拌器上攪拌，使其充分溶解后加入濃鹽酸調(diào)整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 滅菌后于室溫保存。 0.5 M EDTA (pH 8.0): 稱取EDTA-Na2鹽 187 g 加入約 800 ml水，在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入固體NaOH，當(dāng)EDTA和NaOH均完全溶解，溶液變清時其pH值剛好達(dá)到8.0左右，再用pH試紙略加調(diào)整即可， 滅菌后于室溫保存。 5.0 M NaCl: 稱取NaCl 300 g， 加入蒸餾水約800 ml 于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?，約5分鐘后停止攪拌，靜止2~3分鐘，倒出上清液，再加入100 ml蒸餾水重復(fù)前面的步驟，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml.， 滅菌后于室溫保存。 酚：氯仿：異戍醇（25：24：1）的配制：可參考《分子克隆》亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ，蒸餾水50 ml，8-羥基喹嚀0.05g 加入500 ml玻璃燒杯于磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌，待酚達(dá)到水飽和后加入18 g Tris-Base，等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿：異戌醇（24：1），攪拌10~20分鐘，靜止約10分鐘，除去上層水相后，裝入棕色瓶，Z后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保護(hù)液于4℃保存。 DNA Buffer的配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0): 100 ml 5.0 M NaCl: 300 ml H2O 500 ml 滅菌后于室溫下保存3個月左右，用時按1.5%往Buffer中加入CTAB，在電爐上燒開；在通風(fēng)櫥里加入1%的巰基乙醇( 現(xiàn)配現(xiàn)用)。 DNA的提?。? 1 取2~5 g葉片或愈傷組織，加入適量液氮研碎，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管，加入20 ml DNA提取緩沖液充分搖勻，于65℃水浴60~90 min，中途輕輕搖勻兩次。 2 加入15 ml 氯仿：異戍醇（24：1）輕輕搖勻10分鐘，于BECKMAN離心機中4000 rpm離心15分鐘。 3 取上清液于另一50 ml離心管加入10 ml 氯仿：異戍醇（24：1）重復(fù)步驟2。 4 吸上清液于一干凈的50 ml 離心管，加入15 ml 冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于-20℃冷凍半小時，4000 rpm離心10分鐘。棄上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或過夜），中途換乙醇2-3次。 5 棄乙醇風(fēng)干沉淀約半小時，加入3.0 ml TE緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA ， pH 8.0），20 µl RNase A（10 mg/ml），37℃溫浴過夜。 6 溶液轉(zhuǎn)入一10 ml離心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）充分顛倒混勻，4000 rpm離心15 min，吸上清液于另一10 ml的離心管中，（可重復(fù)一次）。 7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水飽和，充分混勻，4000 rpm離心5 min。 8 棄，用20 µl槍頭擋住離心管管口內(nèi)側(cè)，用力下壓槍頭，使槍頭與管壁間形成一狹縫，讓下清液從縫中流入另一10 ml離心管。 9 加入5 ml冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于-20℃冷凍半小時，4000 rpm離心10分鐘。棄上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡4~6 h（或過夜），中途換乙醇2-3次。風(fēng)干乙醇，加入500 µl TE溶解，或浸在乙醇中長期保存。 DNA檢測 1 取DNA原液15 µl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計測定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。 高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7<A260/A280<1.9 2 將DNA原液適當(dāng)稀釋后，用1 Χ TAE，0.8%瓊脂糖凝膠2V/cm電泳1 h進(jìn)行質(zhì)量檢測。 3 向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至4-5U/μg DNA，37℃消化過夜，用0.5 Χ TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進(jìn)行檢測。 CTAB法微量提取DNA 1. 藥品的配制: CTAB提取液： (1)100mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(PH 8.0) (2)1% PVP，2% CTAB (3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀，后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。 苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）： 重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩? 2. 材料的采取與保存： 在超凈工作臺上，取試管苗葉片，放入無菌的1.5 ml離心管中，置于冰盒中，然后把裝有葉片的離心管一起裝在紗布袋中，置液氮中冷凍10分鐘，取出后置于—70℃冰箱中可長期保存，需要用時，取出置于冰盒中。 3．DNA的粗提 在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用事先滅過菌的—20℃冰箱中預(yù)冷的尖頭玻棒將材料戳到底部，先壓后研磨，研細(xì)后加入600 ul CTAB提取液，再繼續(xù)研磨一會兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60-90分鐘，隔30分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入700ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），，上下晃動10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無水乙醇1ml，輕輕顛倒數(shù)次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時或過夜，8000rpm離心5分鐘，棄酒精之后在工作臺上風(fēng)干DNA，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。 4. DNA的純化： 向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1xTE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，然后加入700ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會（冬季）；10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700ul氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 -12000rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入1ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50-100ul1xTE充分溶解，然后每管加5ul 5mg/ml Rnase，37℃水浴6小時或過夜。 5. DNA檢測: （1）0.8%瓊脂糖凝膠電泳30-60分鐘： TAE 100ml，EB 30ul，樣品3-5ul，電壓90V， 觀察A：DNA是否跑出，帶型是否整齊劃一；B：RNA是否除盡 （2）分光光度計檢測D260/D280的比值：在1.8-2.0的范圍內(nèi)認(rèn)為純度較高上述方法提取的DNA比值在1.65-1.95之間。濃度=30000xOD260（DNA樣品為5ul時）。 不知道你說的是動物的還是植物的，我當(dāng)年做的是動物的。用的是雞血，因為在學(xué)校，沒有生物書，只能粗略的查一下了 1、實驗中兩次使用蒸餾水。 diyi次，取血細(xì)胞液時加蒸餾水，目的是讓血細(xì)胞吸水漲破 第二次是在析出含DNA的粘稠物后，目的是稀釋NACL溶液，使DNA逐漸析出 2、加3次NACL， diyi次，在溶解核內(nèi)DNA時，加入NACL后充分?jǐn)嚢瑁铀偃旧|(zhì)中DNA與蛋白質(zhì)的分離，使DNA充分游離并融入NACL中 第二次在DNA粘稠物在溶解時，家NACL是使DNA再溶解 第三次是在DNA的鑒定中，目的是溶解DNA 3、過濾3次 diyi次在提取血細(xì)胞核物質(zhì)時進(jìn)行過濾，取得的濾液中含有染色質(zhì)，而濾出的是細(xì)胞膜、核膜和細(xì)胞器等的破碎結(jié)構(gòu) 第二次在濾去含有DNA粘稠物只能夠，濾液中含有仍然溶解在NACL中的細(xì)胞中的一些成分，如蛋白質(zhì)等 第三次在過濾含DNA的2mol/L的NACL溶液時，過濾后的濾液中含有DNA

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