分辨組織樣本的結(jié)構(gòu)，了解顯微鏡在病理學(xué)應(yīng)用中的多種功能

談到顯微鏡在病理學(xué)家日常工作中的用處時，我們通常會想到診斷。除了病理學(xué)實驗室工作流的這一階段，顯微鏡在更早期的階段也發(fā)揮著重要作用。實驗室技術(shù)員或病理學(xué)家使用顯微鏡檢查樣本染色情況。

如果樣本不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下只能看到組織切片或涂片標(biāo)本的基本結(jié)構(gòu)，但卻無法看到進一步的細節(jié)。對于對比度不足的非常薄的切片尤其如此，有時幾乎是半透明狀態(tài)。 

圖1：圖像中所示為未染色的組織切片。沒有蘇木精和伊紅等染色，幾乎無法識別不同的細胞類型或組織結(jié)構(gòu)，也就很難從圖像中獲取有用信息，甚至無法進行有效的診斷。

經(jīng)染色處理后，樣本的不同部分顯示為不同的顏色和染色強度，從而使組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)可見。最常見的染色組合是蘇木精和伊紅，簡稱為H&E染色。

圖2：載玻片浸入不同的溶液中進行染色。

H&E染色的原理

H&E染色前，首先要對組織進行固定、脫水、包埋和切片處理，然后將切片貼到載玻片上。染色前，一般需要使用二甲苯等溶劑移除包埋介質(zhì)，通常為固體石蠟。然后將切片通過分級醇溶液，降低濃度并置于水中對切片補水。

在下一步中，將切片浸入蘇木精溶液中，對細胞核進行染色。染色的強度取決于組織類型、切片厚度、浸泡時間等因素。觀察玻片的病理學(xué)家的偏好也有影響。用水沖洗后，用藍色染色液將蘇木精的紅染色變?yōu)樗{色。 

圖3：圖中顯示了40倍放大倍率下十二指腸內(nèi)的細胞核。它們使用蘇木精染為藍色。盡管組織內(nèi)的細胞很密集，伊紅產(chǎn)生的淡粉色染色依然能夠顯示組織內(nèi)的皺褶和其它結(jié)構(gòu)。

檢查強度和背景染色

在顯微鏡下快速觀察后，實驗室技術(shù)員或病理學(xué)家便可判斷染色是否充分或過度。如果染色不充分，便需要在蘇木精中再次浸染。如果染色濃度過強，切片顯示背景染色，他們會使用酸性溶液淡化染色，實現(xiàn)切片染色的差異化。這一步驟后，需要再次使用藍色染液并在自來水下沖洗。 

下一步是伊紅染色。伊紅是蘇木精的復(fù)染劑，可差異化地染出紅細胞、膠原，并通過粉色展現(xiàn)出平滑肌。分化同樣需要根據(jù)組織的情況用水洗去過量的伊紅。然后將染色后的玻片浸入梯度乙醇中，再浸入二甲苯，對玻片脫水。完成染色和脫水后，使用封片劑來封裝切片。 

何時檢查染色 

究竟是在蘇木精染色后在顯微鏡下檢查染色和分化，還是在伊紅染色后，不同的方案做法也不同。在蘇木精染色后檢查，無論是再次浸染還是重復(fù)分化，都方便立即調(diào)整。在伊紅染色后檢查，可以讓實驗室技術(shù)員或病理學(xué)家對全染色玻片有一個更好的了解。 

快速檢查在實驗室工作流中具有重要的作用，可以確保負責(zé)診斷的病理學(xué)家看到需要的細節(jié)信息。

可見結(jié)構(gòu)

使用明場照明可以觀察H&E染色玻片。蘇木精將細胞核染為藍紫色，伊紅將細胞質(zhì)和結(jié)締組織染為淺粉色。借助染色，病理學(xué)家可以輕松辨別不同的組織類型，例如肌肉或結(jié)締組織，并發(fā)現(xiàn)切片中的畸形或不規(guī)則情況。這可以幫助它們識別反應(yīng)特定的病理的變化，例如感染、慢性炎癥或惡性腫瘤。借助可見信息，病理學(xué)家可以觀察到組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，從而確定疾病的性質(zhì)和進展。

圖4：5倍放大倍率下的總覽圖顯示了十二指腸中的三層組織：漿膜、粘膜下層和粘膜區(qū)域。每個區(qū)域?qū)μK木精和伊紅會有不同的反應(yīng)，因此借助染料可以輕松辨別邊界層。為識別潛在病灶，關(guān)鍵是要準(zhǔn)確確定發(fā)生病理變化的確切組織部位和細胞類型。

圖5：40倍放大倍率下的十二指腸顯示了粘膜下層和粘膜區(qū)域之間的邊界。通過H&E染色，可以輕松辨別不同的細胞類型。一種細胞突破兩個組織隔室之間的天然障礙，通常為癌癥進展的一種常見指示。

顏色差異

染色工作流和診斷中使用的顯微鏡需要可以很好的辨別顏色差異，這對及時、準(zhǔn)確的診斷至關(guān)重要。檢查染色時，通常使用小尺寸的獨立正置顯微鏡，因為實驗室工作臺一般都比較擁擠。 

診斷使用的顯微鏡則應(yīng)配置性能優(yōu)異的相機，以便拍攝到報告和歸檔所需的細微的顏色差異。注釋功能也有助于創(chuàng)建報告。如果您想了解更多關(guān)于適當(dāng)臨床顯微鏡的信息，可以閱讀文章“如何選擇臨床顯微鏡”。

推薦閱讀：

· P. Zorzi, C. Müller, Factors for Selecting Clinical Microscopes, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· M.?Barszczewski,?P. Zorzi, P. Laskey, C. Müller, Clinical Microscopy: Considerations on Camera Selection, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· C. Alwssandro, How to Benefit from Digital Cytopathology, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· P. Zorzi, C. Müller, The Time to Diagnosis is Crucial in Clinical Pathology, Science Lab (2022) Leica Microsystems

相關(guān)產(chǎn)品

本文節(jié)選自《實驗卒中手術(shù)學(xué)》主編：楊國源

書號：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

1.冰凍切片蘇木素伊紅染色

1、將4%多聚甲醛灌注后的大腦，用冰凍切片機切片，厚度為10~40微米。

2、將腦片貼在載玻片上，并且吹干過夜。

3、將腦片脫脂（若是腦組織直接冰凍，則不需要脫脂）：

       （a）將腦片浸沒在氯仿和乙醇混合物中至少1小時。

       （b）將腦片分別在、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分鐘，然后用蒸餾水沖洗。

注意：必須等到片子完全干燥（沒有水滴）。如果腦片是幾天前準(zhǔn)備的，在染色之前必須放到蒸餾水中浸泡5分鐘。

4、染色步驟：

       （a）將蘇木素滴在腦片上，染色20~25分鐘。整個過程用眼睛或顯微鏡觀察，保證細胞核變藍。

       （b）用蒸餾水洗2次。

       （c）用0.25%的氨水溶液輕輕沖洗約10秒。

       （d）用蒸餾水洗2次。

       （e）用伊紅染色10秒

       （f）用蒸餾水洗2次。

       （g）用70%、80%、90%、95%、的乙醇脫水1次，每次3分鐘。

       （h）用乙醇與二甲苯混合液脫水3分鐘。

       （i）用二甲苯處理5分鐘

       （j）滴2~3滴封片劑，用蓋玻片封住腦片，準(zhǔn)備在顯微鏡下觀察。

2.石蠟切片的蘇木素-伊紅染色

1、修剪組織：如果大腦固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪組織必須在通風(fēng)櫥里進行。去除小腦和嗅球部分。大腦用水沖洗干凈，冠狀切片切成3份。組織放在生理鹽水中。

2、處理以及石蠟包埋：在自動包埋機上進行包埋。金屬盒放在機器中過夜。組織進行梯度脫水，并用石蠟進行包埋。

3、組織包埋的步驟:

       （a）加熱溫度控制在59~61℃；

       （b）樣品控制臺溫度在59~61℃；

       （c）冷凍臺溫度為5℃；

       （d）組織轉(zhuǎn)移到加熱臺上，浸在石蠟中，然后移至樣品控制臺。

注意：不要把樣品放反了，同時要保持它們的方向一致。把鐵塊放在冷凍臺上，冷卻20分鐘。

4、室溫下在切片機上切片：

       （a）水浴溫度控制在45~50℃。

       （b）石蠟組織放在冰水混合物中。

       （c）室溫下設(shè)置好切片機。

       （d）45℃，吹干載玻片20分鐘。

       （e）蠟塊固定在切片機上，修整蠟塊表面，直至大腦組織出現(xiàn)。

       （f）切片，厚度可根據(jù)試驗要求，切成4~10微米。

       （g）腦片轉(zhuǎn)移到水浴中，然后貼在載玻片上。

5、預(yù)染：載玻片在60℃的烘箱中烤片15分鐘，融化石蠟，使乙醇揮發(fā)。注意用架子架住載玻片。

6、HE染色：可以自動也可以手動進行。

1）自動：染色在染色機中進行，依次用以下溶液處理：

       （a）3次二甲苯；

       （b）2次乙醇；

       （c）2次95%乙醇；

       （d）蘇木素染色；

       （e）2次95%乙醇；

       （1）70%乙醇；

       （g）伊紅染色；

       （h）70%乙醇；

       （i）3次二甲苯。

2）手動：每一步驟約1~2分鐘，整個過程需要25~30分鐘。載玻片放入盒子中，滴2~3滴封片劑，然后用蓋玻片小心地蓋在上面。

① 注意事項：

       （a）封片前片子不要干燥，封片劑將地封住腦片；

       （b）在完全干燥之前保證片子平整；

       （c）在顯微鏡下觀察片子的染色效果。例如：如果組織在冰盒中的浸泡時間不足夠長，組織看起來會有皺褶。如果漂片溫度太高，片子會碎，如果溫度太低，片子不能漂浮。

② 手動的HE染色方法：

       （a）3次二甲苯，每次2分鐘，脫去脂肪和蠟；

       （b）乙醇，每片10滴；

       （c）95%乙醇，2次，每片10滴；

       （d）蒸餾水洗；

       （e）蘇木素染色15分鐘；

       （f）蒸餾水洗2次；

       （g）0.25%氨水洗，直至組織變藍；

       （h）蒸餾水洗2次；

       （i）0.5%的伊紅染色，每片10~20滴；

       （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

       （k）乙醇，每片10滴；

       （l）3次二甲苯，每片10滴。

蘇木素伊紅染色后細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈粉紅色或紅色。如下圖所示：

文末福利

掃描下方二維碼，申請SYRFLSI Ⅲ激光散斑血流成像系統(tǒng)，造模完畢即可檢測造模效果。點擊查看大腦中動脈缺血模型的操作步驟。

提交申請后7個工作日內(nèi)

我們的工作人員會與您聯(lián)系

顯微鏡相機應(yīng)用于HE染色觀察

HE染色可看大體病理改變，用染料把堿性和酸性物質(zhì)直接染成藍色或紅色，顯微鏡下可直接觀察組織或細胞的形態(tài)。在臨床上是診斷惡性腫瘤和腫瘤的很好的方法。生物顯微鏡ML31用于HE染色觀察，具有易用舒適，穩(wěn)定可靠的優(yōu)勢。

近期，明美廣州區(qū)域安裝生物顯微鏡ML31搭配630萬像素顯微鏡相機MS60，用于HE染色片的觀察并能清晰拍照。在顯微鏡下做診斷其實并不容易，這需要大量知識的學(xué)習(xí)和豐富的經(jīng)驗積累，而好的顯微鏡能有效提升效率，ML31采用高平場性物鏡，保證10X/22視野數(shù)下的平坦清晰成像。

生物顯微鏡ML31采用人機工程學(xué)設(shè)計，不斷為操作者更加提供好的使用體驗，避免長期使用帶來的疲勞感；另外通過光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)化升級，使得操作更簡便，減少培訓(xùn)成本，易上手。

生物顯微鏡ML31采用高透光平場消色差物鏡，成像清晰無場曲，標(biāo)配明場成像，無限遠光學(xué)系統(tǒng)，擴展?jié)摿Υ?，可擴展用于暗場、相差、熒光多功能顯微觀察。

您若對生物顯微鏡感興趣或存在疑問，歡迎與我們聯(lián)系，我們將竭誠為您服務(wù)！

免責(zé)聲明

本站無法鑒別所上傳圖片、字體或文字內(nèi)容的版權(quán)，如無意中侵犯了哪個權(quán)利人的知識產(chǎn)權(quán)，請來信或來電告之，本站將立即予以刪除，謝謝。 

來源：https://www.mshot.com/article/1765.html

HE染色法又稱蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining)，是一種廣泛用于臨床和實驗中的染色方法。將以蘇木精染液和伊紅染液先后將特定的細胞成分上色，由于蘇木精染液為堿性，使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色；伊紅為酸性染料，使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色。通過HE的染色，各種組織或細胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點均可顯示出來，HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法，一般搭配生物顯微鏡進行觀察。

近期潮汕職業(yè)技術(shù)學(xué)院老師需要一臺顯微鏡和相機對HE染色切片進行觀察，且需要拍照以及錄像功能模塊，明美銷售經(jīng)理推薦生物顯微鏡ML31搭配顯微鏡相機MSX1

生物顯微鏡ML31搭配顯微鏡相機MSX1拍攝的HE染色片

生物顯微鏡ML31是一款采用無限遠光學(xué)設(shè)計的高倍放大顯微鏡，配備平場消色差物鏡和長壽命LED透射光源，柯勒式照明，可以獲得清晰、平坦、高襯度的成像效果，可以用來觀察植物切片、植物細胞，或者半透明物體以及粉末、細小顆粒等樣品。

顯微數(shù)字相機MSX1采用高性能成像芯片，內(nèi)置MS系列硬件ISP圖像處理芯片，針對顯微鏡拍攝場景特別優(yōu)化，精確還原樣品的精細結(jié)構(gòu)和真實色彩，通過硬件加速，極大提升了相機運行速度，是病理診斷、金相分析和體視觀察等應(yīng)用領(lǐng)域的理想工具。

如果您對HE染色片顯微鏡感興趣或有疑問，歡迎與我們聯(lián)系，期待與您相約！

來源：http://www.mshot.com.cn/kehuanli/2023131.html，轉(zhuǎn)載請保留出處，謝謝！

癌細胞在顯微鏡下是什么樣的？

癌細胞是正常細胞基因突變的結(jié)果，其反應(yīng)和行為異常，沒有正常細胞的壽命限制，充當(dāng)攻擊某些身體部位的侵入性生物，導(dǎo)致腫瘤和繼發(fā)性惡性生長。通過顯微鏡觀察可研究如何對癌細胞進行靶向研究。

某醫(yī)院需運用熒光顯微成像技術(shù)對癌細胞進行靶向研究和評估，明美工程師推薦了倒置熒光顯微鏡MF52-N, 配備數(shù)顯LED熒光模塊，可即開即用，可實現(xiàn)相差觀察、熒光觀察和明場觀察，滿足不同的應(yīng)用；可個性化選擇熒光通道，實現(xiàn)多種熒光信號觀測。呈現(xiàn)效果用戶滿意。

倒置熒光顯微鏡MF52-N可選高靈敏度相機，弱熒光信號捕獲能力強，成像效果優(yōu)異。此次搭配2000萬高像素高清相機MDX10，分辨率調(diào)高，靈敏度良好，針對顯微成像深度優(yōu)化，成像清晰。

倒置熒光顯微鏡MF52-N可應(yīng)用于細胞組織，透明液態(tài)組織的顯微觀察，也可用于生物制藥，醫(yī)學(xué)檢測、疾病預(yù)防等領(lǐng)域內(nèi)的熒光顯微觀察。

您若對顯微鏡感興趣或存在疑問，歡迎與我們聯(lián)系，我們將竭誠為您服務(wù)！

免責(zé)聲明

本站無法鑒別所上傳圖片、字體或文字內(nèi)容的版權(quán)，如無意中侵犯了哪個權(quán)利人的知識產(chǎn)權(quán)，請來信或來電告之，本站將立即予以刪除，謝謝。

來源：https://www.mshot.com/article/1586.html

一、熒光基礎(chǔ)知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出其他波長的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團的激發(fā)峰值和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長比激發(fā)光更長。

熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標(biāo)記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術(shù)中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在熒光顯微技術(shù)中具體體現(xiàn)為以下幾個關(guān)鍵部件：

（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個指標(biāo)

? 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團在特定波段范圍才能被大部分激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團激發(fā)特征。

? 發(fā)射光譜波段的強度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強信號的發(fā)射熒光信號。

（明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功）

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個

? 激發(fā)濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

? 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團發(fā)射的特定波段的光通過

? 二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

（明美可定制適配四家品牌，不同波段需求的激發(fā)塊）

二、熒光顯微成像的應(yīng)用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學(xué)）、礦物、材料科學(xué)等領(lǐng)域的顯微熒光觀測。①在生物學(xué)領(lǐng)域，主要借助熒光染料標(biāo)記，可準(zhǔn)確和詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分。②在礦物學(xué)領(lǐng)域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學(xué)，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導(dǎo)體領(lǐng)域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

（MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片）

熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用是廣泛也是復(fù)雜的，主要是對細菌、細胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進行標(biāo)記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進行標(biāo)記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標(biāo)記的位置，二是該染料對應(yīng)的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對核酸、聚糖進行染色，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測。以下根據(jù)染料結(jié)合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應(yīng)用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標(biāo)記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術(shù)利用抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的特性，主要有兩種方式：一是利用內(nèi)源熒光信號，即通過克隆技術(shù)用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標(biāo)記的抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。

? FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質(zhì)上的基團結(jié)合，主要用于免疫熒光和流式細胞術(shù)中。

? TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質(zhì)結(jié)合。

? 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，從而讓標(biāo)記顯影時背景弱，信號強。除細胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學(xué)顯影、小動物體內(nèi)成像等。

? Alexa Fluor系列：屬于帶負電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標(biāo)識涵蓋了對應(yīng)的激發(fā)波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標(biāo)記核酸。同蛋白質(zhì)一樣，對核酸進行標(biāo)記與研究同樣有重要意義，如對細胞核（主要成分為核酸）進行染色標(biāo)記可以判斷細胞的數(shù)量和位置。

? DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時，在358nm處有一個吸收峰值，在461nm處有一個發(fā)射峰值，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可與RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果。DAPI可以透過完整的細胞膜，因此被廣泛用于活細胞和固定細胞的染色。

? Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細胞膜，被廣泛用于活細胞和固定細胞染色。

? PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細胞膜的DNA染色劑。與核酸結(jié)合后，激發(fā)波長為538 nm，發(fā)射波長為617 nm。由于該染色劑無法進入完整的細胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細胞群中的活細胞和死細胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）離子成像：研究細胞中各種離子的流動與分布對細胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結(jié)合形成熒光團，利用光譜特征檢測對應(yīng)離子的分布狀態(tài)。

三、熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應(yīng)用熒光顯微技術(shù)進行成像的過程中，不僅要考慮成像的質(zhì)量，包括分辨率、對比度、熒光信號強弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術(shù)應(yīng)用中的常見挑戰(zhàn)與應(yīng)對方法：

汞燈需搭配帶計時器的復(fù)雜控制箱來使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強，但使用有很多麻煩，首先需要預(yù)熱，然后光強靠ND濾鏡調(diào)節(jié)，壽命較短可能就200小時，在壽命用完前還會有光強衰減問題，需要調(diào)整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應(yīng)用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強更穩(wěn)定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四家品牌的濾光片組

（2）濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會對熒光效果產(chǎn)生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四家品牌顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四家品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

（MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像）

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學(xué)領(lǐng)域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細胞內(nèi)的有機分子在與氧反應(yīng)時吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應(yīng)對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)時間，需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時間的熒光成像中，這種情況需要提高相機的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

（單通道熒光拍攝，經(jīng)軟件合成多色熒光圖像）

（4）多色熒光成像：在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，尤其是在對活細胞標(biāo)記成像時，需同時對多種物質(zhì)進行標(biāo)記，并在一個圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標(biāo)記時會出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對于多色熒光成像，有兩種應(yīng)對思路，一是針對每種染料使用對應(yīng)的單通道窄帶濾光片，后通過軟件進行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實現(xiàn)一組濾光片同時觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區(qū)分。

（雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時觀察到B\G兩種熒光信號）

來源：https://www.mshot.com/article/1527.html