HE染色法又稱蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining)，是一種廣泛用于臨床和實驗中的染色方法。將以蘇木精染液和伊紅染液先后將特定的細胞成分上色，由于蘇木精染液為堿性，使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色；伊紅為酸性染料，使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色。通過HE的染色，各種組織或細胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點均可顯示出來，HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法，一般搭配生物顯微鏡進行觀察。

近期潮汕職業(yè)技術(shù)學院老師需要一臺顯微鏡和相機對HE染色切片進行觀察，且需要拍照以及錄像功能模塊，明美銷售經(jīng)理推薦生物顯微鏡ML31搭配顯微鏡相機MSX1

生物顯微鏡ML31搭配顯微鏡相機MSX1拍攝的HE染色片

生物顯微鏡ML31是一款采用無限遠光學設計的高倍放大顯微鏡，配備平場消色差物鏡和長壽命LED透射光源，柯勒式照明，可以獲得清晰、平坦、高襯度的成像效果，可以用來觀察植物切片、植物細胞，或者半透明物體以及粉末、細小顆粒等樣品。

顯微數(shù)字相機MSX1采用高性能成像芯片，內(nèi)置MS系列硬件ISP圖像處理芯片，針對顯微鏡拍攝場景特別優(yōu)化，精確還原樣品的精細結(jié)構(gòu)和真實色彩，通過硬件加速，極大提升了相機運行速度，是病理診斷、金相分析和體視觀察等應用領(lǐng)域的理想工具。

如果您對HE染色片顯微鏡感興趣或有疑問，歡迎與我們聯(lián)系，期待與您相約！

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顯微鏡相機應用于HE染色觀察

HE染色可看大體病理改變，用染料把堿性和酸性物質(zhì)直接染成藍色或紅色，顯微鏡下可直接觀察組織或細胞的形態(tài)。在臨床上是診斷惡性腫瘤和腫瘤的很好的方法。生物顯微鏡ML31用于HE染色觀察，具有易用舒適，穩(wěn)定可靠的優(yōu)勢。

近期，明美廣州區(qū)域安裝生物顯微鏡ML31搭配630萬像素顯微鏡相機MS60，用于HE染色片的觀察并能清晰拍照。在顯微鏡下做診斷其實并不容易，這需要大量知識的學習和豐富的經(jīng)驗積累，而好的顯微鏡能有效提升效率，ML31采用高平場性物鏡，保證10X/22視野數(shù)下的平坦清晰成像。

生物顯微鏡ML31采用人機工程學設計，不斷為操作者更加提供好的使用體驗，避免長期使用帶來的疲勞感；另外通過光學系統(tǒng)優(yōu)化升級，使得操作更簡便，減少培訓成本，易上手。

生物顯微鏡ML31采用高透光平場消色差物鏡，成像清晰無場曲，標配明場成像，無限遠光學系統(tǒng)，擴展?jié)摿Υ?，可擴展用于暗場、相差、熒光多功能顯微觀察。

您若對生物顯微鏡感興趣或存在疑問，歡迎與我們聯(lián)系，我們將竭誠為您服務！

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分辨組織樣本的結(jié)構(gòu)，了解顯微鏡在病理學應用中的多種功能

談到顯微鏡在病理學家日常工作中的用處時，我們通常會想到診斷。除了病理學實驗室工作流的這一階段，顯微鏡在更早期的階段也發(fā)揮著重要作用。實驗室技術(shù)員或病理學家使用顯微鏡檢查樣本染色情況。

如果樣本不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下只能看到組織切片或涂片標本的基本結(jié)構(gòu)，但卻無法看到進一步的細節(jié)。對于對比度不足的非常薄的切片尤其如此，有時幾乎是半透明狀態(tài)。 

圖1：圖像中所示為未染色的組織切片。沒有蘇木精和伊紅等染色，幾乎無法識別不同的細胞類型或組織結(jié)構(gòu)，也就很難從圖像中獲取有用信息，甚至無法進行有效的診斷。

經(jīng)染色處理后，樣本的不同部分顯示為不同的顏色和染色強度，從而使組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)可見。最常見的染色組合是蘇木精和伊紅，簡稱為H&E染色。

圖2：載玻片浸入不同的溶液中進行染色。

H&E染色的原理

H&E染色前，首先要對組織進行固定、脫水、包埋和切片處理，然后將切片貼到載玻片上。染色前，一般需要使用二甲苯等溶劑移除包埋介質(zhì)，通常為固體石蠟。然后將切片通過分級醇溶液，降低濃度并置于水中對切片補水。

在下一步中，將切片浸入蘇木精溶液中，對細胞核進行染色。染色的強度取決于組織類型、切片厚度、浸泡時間等因素。觀察玻片的病理學家的偏好也有影響。用水沖洗后，用藍色染色液將蘇木精的紅染色變?yōu)樗{色。 

圖3：圖中顯示了40倍放大倍率下十二指腸內(nèi)的細胞核。它們使用蘇木精染為藍色。盡管組織內(nèi)的細胞很密集，伊紅產(chǎn)生的淡粉色染色依然能夠顯示組織內(nèi)的皺褶和其它結(jié)構(gòu)。

檢查強度和背景染色

在顯微鏡下快速觀察后，實驗室技術(shù)員或病理學家便可判斷染色是否充分或過度。如果染色不充分，便需要在蘇木精中再次浸染。如果染色濃度過強，切片顯示背景染色，他們會使用酸性溶液淡化染色，實現(xiàn)切片染色的差異化。這一步驟后，需要再次使用藍色染液并在自來水下沖洗。 

下一步是伊紅染色。伊紅是蘇木精的復染劑，可差異化地染出紅細胞、膠原，并通過粉色展現(xiàn)出平滑肌。分化同樣需要根據(jù)組織的情況用水洗去過量的伊紅。然后將染色后的玻片浸入梯度乙醇中，再浸入二甲苯，對玻片脫水。完成染色和脫水后，使用封片劑來封裝切片。 

何時檢查染色 

究竟是在蘇木精染色后在顯微鏡下檢查染色和分化，還是在伊紅染色后，不同的方案做法也不同。在蘇木精染色后檢查，無論是再次浸染還是重復分化，都方便立即調(diào)整。在伊紅染色后檢查，可以讓實驗室技術(shù)員或病理學家對全染色玻片有一個更好的了解。 

快速檢查在實驗室工作流中具有重要的作用，可以確保負責診斷的病理學家看到需要的細節(jié)信息。

可見結(jié)構(gòu)

使用明場照明可以觀察H&E染色玻片。蘇木精將細胞核染為藍紫色，伊紅將細胞質(zhì)和結(jié)締組織染為淺粉色。借助染色，病理學家可以輕松辨別不同的組織類型，例如肌肉或結(jié)締組織，并發(fā)現(xiàn)切片中的畸形或不規(guī)則情況。這可以幫助它們識別反應特定的病理的變化，例如感染、慢性炎癥或惡性腫瘤。借助可見信息，病理學家可以觀察到組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，從而確定疾病的性質(zhì)和進展。

圖4：5倍放大倍率下的總覽圖顯示了十二指腸中的三層組織：漿膜、粘膜下層和粘膜區(qū)域。每個區(qū)域?qū)μK木精和伊紅會有不同的反應，因此借助染料可以輕松辨別邊界層。為識別潛在病灶，關(guān)鍵是要準確確定發(fā)生病理變化的確切組織部位和細胞類型。

圖5：40倍放大倍率下的十二指腸顯示了粘膜下層和粘膜區(qū)域之間的邊界。通過H&E染色，可以輕松辨別不同的細胞類型。一種細胞突破兩個組織隔室之間的天然障礙，通常為癌癥進展的一種常見指示。

顏色差異

染色工作流和診斷中使用的顯微鏡需要可以很好的辨別顏色差異，這對及時、準確的診斷至關(guān)重要。檢查染色時，通常使用小尺寸的獨立正置顯微鏡，因為實驗室工作臺一般都比較擁擠。 

診斷使用的顯微鏡則應配置性能優(yōu)異的相機，以便拍攝到報告和歸檔所需的細微的顏色差異。注釋功能也有助于創(chuàng)建報告。如果您想了解更多關(guān)于適當臨床顯微鏡的信息，可以閱讀文章“如何選擇臨床顯微鏡”。

推薦閱讀：

· P. Zorzi, C. Müller, Factors for Selecting Clinical Microscopes, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· M.?Barszczewski,?P. Zorzi, P. Laskey, C. Müller, Clinical Microscopy: Considerations on Camera Selection, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· C. Alwssandro, How to Benefit from Digital Cytopathology, Science Lab (2022) Leica Microsystems

· P. Zorzi, C. Müller, The Time to Diagnosis is Crucial in Clinical Pathology, Science Lab (2022) Leica Microsystems

相關(guān)產(chǎn)品

國外某生物YL單位已有顯微鏡，希望看FITC  PI熒光染色切片

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡(FITC-PI)

實驗方法：

1．用6孔板培養(yǎng)細胞，待細胞生長達到60%-70%，吸出舊培養(yǎng)基，根據(jù)實驗需求處理，繼續(xù)培養(yǎng)。

2．根據(jù)實驗處理時間，把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。（注意：懸浮細胞不需要胰酶消化，直接收集到離心管即可）

3．加入步驟(2)中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。（注意：加入步驟2）中的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效YZ或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導致染色失敗。

解決方案：

明美外貿(mào)同事和客戶溝通后推薦了明美熒光模塊MF-B-LED,當時覺得長通的模塊還是能看到PI,和技術(shù)等溝通評估后換成窄帶，成功解決了這個問題；明美熒光模塊可配藍色、綠色、寶藍、紫外等激發(fā)光組；可應用于呼吸道疾病、生殖道疾病、結(jié)核桿菌、自身免疫性疾病等領(lǐng)域熒光的檢測。通過推拉滑塊即可在明場或熒光的觀察方式之間進行切換；不僅可以匹配明美顯微鏡使用，也可以匹配其他廠家顯微鏡，例如：奧林巴斯顯微鏡，尼康顯微鏡（以上顯微鏡，均采用無限遠光學系統(tǒng) ）；方便顯微鏡升級改造。良好的表現(xiàn)，貼切的價格，會讓你驚嘆！

（來源：http://www.mshot.com/kehuanli/20191203.html廣州市明美光電技術(shù)有限公司）

一、熒光基礎(chǔ)知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出其他波長的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團的激發(fā)峰值和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長比激發(fā)光更長。

熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術(shù)中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在熒光顯微技術(shù)中具體體現(xiàn)為以下幾個關(guān)鍵部件：

（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個指標

? 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團在特定波段范圍才能被大部分激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團激發(fā)特征。

? 發(fā)射光譜波段的強度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強信號的發(fā)射熒光信號。

（明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功）

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個

? 激發(fā)濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

? 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團發(fā)射的特定波段的光通過

? 二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

（明美可定制適配四家品牌，不同波段需求的激發(fā)塊）

二、熒光顯微成像的應用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學）、礦物、材料科學等領(lǐng)域的顯微熒光觀測。①在生物學領(lǐng)域，主要借助熒光染料標記，可準確和詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分。②在礦物學領(lǐng)域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導體領(lǐng)域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

（MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片）

熒光顯微技術(shù)在生物學領(lǐng)域中應用是廣泛也是復雜的，主要是對細菌、細胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進行標記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進行標記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標記的位置，二是該染料對應的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對核酸、聚糖進行染色，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測。以下根據(jù)染料結(jié)合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術(shù)利用抗體可以和相應抗原特異性結(jié)合的特性，主要有兩種方式：一是利用內(nèi)源熒光信號，即通過克隆技術(shù)用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標記的抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。

? FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質(zhì)上的基團結(jié)合，主要用于免疫熒光和流式細胞術(shù)中。

? TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質(zhì)結(jié)合。

? 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，從而讓標記顯影時背景弱，信號強。除細胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學顯影、小動物體內(nèi)成像等。

? Alexa Fluor系列：屬于帶負電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標識涵蓋了對應的激發(fā)波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標記核酸。同蛋白質(zhì)一樣，對核酸進行標記與研究同樣有重要意義，如對細胞核（主要成分為核酸）進行染色標記可以判斷細胞的數(shù)量和位置。

? DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當DAPI與雙股DNA結(jié)合時，在358nm處有一個吸收峰值，在461nm處有一個發(fā)射峰值，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可與RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果。DAPI可以透過完整的細胞膜，因此被廣泛用于活細胞和固定細胞的染色。

? Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細胞膜，被廣泛用于活細胞和固定細胞染色。

? PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細胞膜的DNA染色劑。與核酸結(jié)合后，激發(fā)波長為538 nm，發(fā)射波長為617 nm。由于該染色劑無法進入完整的細胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細胞群中的活細胞和死細胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）離子成像：研究細胞中各種離子的流動與分布對細胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結(jié)合形成熒光團，利用光譜特征檢測對應離子的分布狀態(tài)。

三、熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應用熒光顯微技術(shù)進行成像的過程中，不僅要考慮成像的質(zhì)量，包括分辨率、對比度、熒光信號強弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術(shù)應用中的常見挑戰(zhàn)與應對方法：

汞燈需搭配帶計時器的復雜控制箱來使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強，但使用有很多麻煩，首先需要預熱，然后光強靠ND濾鏡調(diào)節(jié)，壽命較短可能就200小時，在壽命用完前還會有光強衰減問題，需要調(diào)整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強更穩(wěn)定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四家品牌的濾光片組

（2）濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會對熒光效果產(chǎn)生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四家品牌顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四家品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

（MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像）

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學領(lǐng)域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細胞內(nèi)的有機分子在與氧反應時吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)時間，需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時間的熒光成像中，這種情況需要提高相機的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

（單通道熒光拍攝，經(jīng)軟件合成多色熒光圖像）

（4）多色熒光成像：在生物學領(lǐng)域應用較多，尤其是在對活細胞標記成像時，需同時對多種物質(zhì)進行標記，并在一個圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標記時會出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對于多色熒光成像，有兩種應對思路，一是針對每種染料使用對應的單通道窄帶濾光片，后通過軟件進行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實現(xiàn)一組濾光片同時觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區(qū)分。

（雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時觀察到B\G兩種熒光信號）

來源：https://www.mshot.com/article/1527.html