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  asling1231211 2017-05-22 00:00:00

  大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備 diyi天： 1. 將適合菌株（如XL1-Blue， DH5α）置于LB或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過夜培養(yǎng) 2. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用 3. 準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用 第二天： 4. 轉(zhuǎn)移0.2-1ml過夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB（或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1-2升擋板搖瓶中 5. 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時(shí) 6. 定時(shí)監(jiān)控O.D.600值（培養(yǎng)1小時(shí)后每半小時(shí)測(cè)定一次） 7. 當(dāng)O.D.600值達(dá)到0.5-1.0時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時(shí)） 8. 細(xì)胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天） 9. 用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中（幾毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。 10. 照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液 11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞 12. 離心，棄上清液 13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞 14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會(huì)很松散） 15. 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至Z終體積為2-3ml 16. 將細(xì)胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存 轉(zhuǎn)化方法:1. 在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞添加1-10μl DNA ，冰上培育約5分鐘 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育約5分鐘 3. 轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中 4. 加載P1000，準(zhǔn)備好300μl LB 或 2xYT 5. 對(duì)電穿孔容器進(jìn)行脈沖（200 歐姆， 25μFd， 2.5 千伏）（檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中 7. 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至1小時(shí)以復(fù)原 8. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素

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