小鼠狂犬病毒抗體(RVAb)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

　　本試劑盒僅供研究使用。

　　檢測范圍：96T5IU/L-150IU/L使用

　　目的：本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中狂犬病毒抗體(RVAb)含量。實驗原理本試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中小鼠狂犬病毒抗體(RVAb)水平。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被的微孔中依次加入狂犬病毒抗體(RVAb)，再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的狂犬病毒抗體(RVAb)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中小鼠狂犬病毒抗體(RVAb)濃度。

　　試劑盒組成

　　130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶2酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品(240IU/L)0.5ml×1瓶3酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個標(biāo)本要求1.標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟

　　1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。120IU/L5號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液60IU/L4號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液30IU/L3號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液15IU/L2號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液7.5IU/L1號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

　　操作程序總結(jié)：

　　計算：

　　以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

　　注意事項

　　1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

　　2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

　　4.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

　　5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6.底物請避光保存。

　　7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

　　9.本試劑不同批號組分不得混用。

　　保存條件及有效期

　　1.試劑盒保存：;2-8℃。

　　2.有效期：6個月

前言

免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，它是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細胞儀）測定含量。

直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

一、實驗步驟

免疫熒光實驗的主要步驟包括 樣片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育、封片及熒光檢測等。

1、 樣品準(zhǔn)備

對于單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過（70%乙醇中浸泡）的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片即可，操作過程要小心，防止細胞脫片。

對于懸浮生長細胞，有兩種方式，一種是取對數(shù)生長細胞，制備細胞片或直接制備細胞涂片，把細胞片浸入封閉液中固定，封閉后滴加一抗和二抗孵育；另一種是先在懸浮液中進行固定和染色，離心洗脫后，用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)抗體孵育。

對于冰凍切片制備，建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。組織一定要冷凍適度，切片時選用干凈鋒利的刀片，防止裂片和脫片。

對于石蠟切片的制備，要先進行脫蠟和抗原修復(fù)的處理。

2、固定

做好切片并風(fēng)干后立即用合適的固定液（固定液包括有機溶劑和交聯(lián)劑，其選擇取決于抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性）進行固定，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。

固定時間則取決于固定組織切片的大小和類型，對大多數(shù)組織，18-24h即可，而細胞的固定時間較短。

3、通透

針對胞內(nèi)抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透劑進行通透，這一步的目的是使抗體進入胞內(nèi)。

4、封閉

為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用封閉液（一般包括與二抗同一來源的血清、BSA或者羊血清）封閉，減弱背景著色。封閉開始后，要注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

5、一抗孵育

一抗孵育溫度一般分為：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果更佳；孵育時間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃孵育1-2h，4℃過夜（從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min）。具體條件還要根據(jù)樣品、稀釋液等條件進行摸索嘗試。

6、熒光二抗孵育

熒光二抗孵育一般在室溫或37℃孵育30min-1h，該過程必須在避光環(huán)境下進行，防止熒光淬滅。熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長，可能會有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時采用小包裝并進行適當(dāng)?shù)碾x心。

7、復(fù)染

一般采用DAPI進行復(fù)染，目的是形成細胞輪廓，從而對目標(biāo)蛋白進行定位。

8、封片

為了長期保存，我們需要對樣本進行封片，用吸水紙吸干爬片上的液體，一般用緩沖甘油等或?qū)ｉT的抗熒光淬滅的封片液。

9、 熒光觀察

有條件的話立即用熒光顯微鏡觀察拍照，若不能及時拍照，也要做好封片和封固，保持避光和濕度。熒光顯微鏡的成像能力對最終的結(jié)果也會造成很大的影響，好的熒光顯微鏡能夠最大限度地收集熒光信號，并呈現(xiàn)高分辨率的圖片，使細節(jié)更清楚，更易得到一張效果極佳的結(jié)果圖。

注意：

切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑?延長時間和增多次數(shù))尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。

(1)單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染；

(2)溫柔沖洗，防止切片的脫落?？墒褂媒捶绞?；

(3)沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)；

(4)PBS的PH和離子強度的使用和要求（建議PH在7.4-7.6，濃度是0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

根據(jù)上述步驟完成免疫熒光實驗后，就需要進行熒光顯微成像，得到我們想要的結(jié)果。選擇一款操作簡單、成像清晰、效果卓越的熒光顯微鏡進行觀察拍照，才能輕松得到更為理想的結(jié)果圖，達到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡作為一款電動化、智能化的顯微鏡，具有以下優(yōu)勢：

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