文章概述

帕金森?。≒arkinson’s disease, PD）患者伴隨有嚴(yán)重的睡眠障礙，包括嗜睡、失眠、快速眼動（Rapid Eye Movement, REM）睡眠行為障礙，有超過50%的PD患者受到嗜睡的影響，但是其機(jī)制目前并不明確。2022年1月11日，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院黃志力和曲衛(wèi)敏教授團(tuán)隊(duì)在《Current Biology》上發(fā)表題“Striatal neurons expressing dopamine D1 receptor promote wakefulness in mice”的文章，該研究證實(shí)了背側(cè)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元（Dopamine D1 Receptor, D1R）在睡眠行為中的作用，揭示了其調(diào)控覺醒的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制，為帕金森病伴發(fā)睡眠障礙的治療提供新策略。

核心觀點(diǎn)

1、紋狀體 D1R 神經(jīng)元在覺醒期高度活躍，在非快速眼動（Non-Rapid Eye Movement, NREM）睡眠期安靜；

2、紋狀體D1R神經(jīng)元的活動與前額葉皮層（Prefrontal Cortex, PFC）和背內(nèi)側(cè)丘腦（Mediodorsal Thalamus, MD）神經(jīng)元高度同步；

3、紋狀體D1R神經(jīng)元通過下游的蒼白球內(nèi)側(cè)部 （Entopeduncular Nucleus, EP）和黑質(zhì)網(wǎng)狀部（Substantia Nigra pars reticulata, SNr）神經(jīng)元控制覺醒。

研究結(jié)果分析

1.激活紋狀體D1R神經(jīng)元能夠誘導(dǎo)小鼠從NREM睡眠到清醒狀態(tài)的瞬時轉(zhuǎn)變

為了研究紋狀體D1R神經(jīng)元對睡眠狀態(tài)的控制作用，研究者用到了D1-ChR2-YFP小鼠，用于進(jìn)行光遺傳刺激，同時結(jié)合在體腦電肌電記錄睡眠-覺醒狀態(tài)。在小鼠NREM睡眠期間，光遺傳激活D1R神經(jīng)元的可誘導(dǎo)小鼠立即從NREM睡眠過渡到清醒狀態(tài)（皮質(zhì)Delta波活動和肌肉張力的出現(xiàn)快速變化）。光刺激紋狀體D1R神經(jīng)元降低腦電Delta波功率，增加肌電均方根值（Root Mean Square, RMS）。在激發(fā)后60 s內(nèi)，從NREM睡眠到覺醒的概率迅速增加；從NREM睡眠到覺醒的潛伏期呈現(xiàn)刺激頻率依賴性的縮短。D1-ChR2-YFP小鼠在1、5、10、20或30 Hz持續(xù)10 s的光刺激下，從NREM睡眠到覺醒的潛伏期分別比對照組小鼠縮短20.3%、37.7%、64.2%、79.4%和84.9%。值得注意的是，大腦狀態(tài)的反應(yīng)對NREM睡眠具有選擇性，在REM睡眠中激活紋狀體D1R神經(jīng)元對大腦狀態(tài)沒有影響。綜上所述，激活紋狀體D1R神經(jīng)元可誘導(dǎo)小鼠從NREM睡眠立即過渡到清醒狀態(tài)。

2. 紋狀體D1R神經(jīng)元在自發(fā)清醒和對外界刺激反應(yīng)時活躍

為了評估自由移動小鼠在自發(fā)睡眠-覺醒狀態(tài)下紋狀體D1R神經(jīng)元的群體活動，研究者利用光纖記錄系統(tǒng)記錄了紋狀體D1R神經(jīng)元的鈣信號，利用腦電肌電記錄系統(tǒng)分析小鼠的睡眠-覺醒狀態(tài)。紋狀體D1R神經(jīng)元鈣信號在小鼠清醒時比REM或NREM時更強(qiáng)。值得注意的是，紋狀體D1R神經(jīng)元在NREM到覺醒過渡之前活動開始增加，而在覺醒到NREM過渡之前活動減少。相比之下，紋狀體D1R神經(jīng)元在從NREM睡眠到REM睡眠或從REM睡眠到覺醒期間的鈣活動沒有顯著差異。這些研究結(jié)果表明，紋狀體D1R神經(jīng)元在從NREM睡眠到清醒的過渡期間活動增加，并且在自發(fā)清醒時最活躍。

為了研究紋狀體D1R神經(jīng)元對外界刺激的反應(yīng)動態(tài)，研究者記錄了不同顯著性刺激下小鼠紋狀體D1R神經(jīng)元的鈣信號。在NREM睡眠或清醒狀態(tài)時，給予70 db、24 khz、持續(xù)5 s的聲音刺激。在NREM睡眠期間，給予聲音刺激，紋狀體D1R神經(jīng)元的活動立即增加，小鼠立即從NREM睡眠轉(zhuǎn)到清醒。在清醒時，給予聲音刺激會進(jìn)一步增加紋狀體D1R神經(jīng)元的活動。其它刺激，比如足底電擊、吹氣等也會導(dǎo)致紋狀體D1R神經(jīng)元活性增加。這些結(jié)果表明，紋狀體D1R神經(jīng)元不僅在自發(fā)清醒時被激活，而且在喚醒刺激時也會被激活。

3. 紋狀體D1R神經(jīng)元與PFC和MD神經(jīng)元在自發(fā)睡眠-覺醒周期中的活動高度同步，并受到它們的調(diào)節(jié)

背側(cè)紋狀體接受來自黑質(zhì)下致密部（Substantia Nigra pars compacta, SNc）的多巴胺能神經(jīng)傳入，以及大腦皮層和丘腦的谷氨酸能神經(jīng)傳入，但是GABA能的神經(jīng)傳入很少被記錄。研究者隨后探討了對背側(cè)紋狀體有神經(jīng)投射的區(qū)域是否也與參與了睡眠-覺醒的轉(zhuǎn)換。利用光纖記錄系統(tǒng)，研究者記錄了小鼠SNc、PFC、和MD在大腦不同狀態(tài)時的鈣活動。與紋狀體D1R神經(jīng)元活動相似，PFC和MD神經(jīng)元在清醒時比NREM睡眠時表現(xiàn)出更高的鈣信號。PFC/MD中谷氨酸能神經(jīng)元和SNc中多巴胺能神經(jīng)元在NREM睡眠到覺醒過渡后活動增加，在覺醒到NREM睡眠過渡后活動降低。

為了明確地靶向支配背側(cè)紋狀體的神經(jīng)元，研究者采用病毒逆行示蹤方法來標(biāo)記這些對背側(cè)紋狀體發(fā)出投射的神經(jīng)元。這些投射到紋狀體的皮層和丘腦神經(jīng)元在NREM睡眠到覺醒過渡期間活動增加，而在覺醒到NREM睡眠的過渡期間活動則減少。并且這些特異性的PFC-紋狀體或MD-紋狀體投射神經(jīng)元的活動比PFC或MD神經(jīng)元活動下降的更快。PFC和MD神經(jīng)元存在許多細(xì)胞類型，并支配許多下游核團(tuán)。這些活動下降率的差異可能歸因投射到紋狀體的神經(jīng)元只是PFC和MD神經(jīng)元的一個亞型。此外，在睡眠或清醒時給予聽覺刺激、足底電擊或者吹氣刺激，PFC和MD神經(jīng)元的活動也會增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，紋狀體D1R神經(jīng)元的活動受到來自PFC和MD興奮性傳入的影響。

為了進(jìn)一步澄清它們之間的聯(lián)系，研究者采用多通道光纖記錄法同時記錄PFC、MD和紋狀體D1R神經(jīng)元的群體鈣活動。結(jié)果顯示紋狀體D1R神經(jīng)元、PFC神經(jīng)元和MD神經(jīng)元的活動在清醒時同時增加，在NREM睡眠時同時減少。Pearson相關(guān)性分析表明，這些腦區(qū)神經(jīng)活動高度同步。PFC-紋狀體投射神經(jīng)元、MD-紋狀體投射神經(jīng)元和紋狀體D1R神經(jīng)元在NREM睡眠到覺醒過渡期間活動增加，并在覺醒到NREM睡眠過渡期間活動降低。

此外，為了進(jìn)一步確定紋狀體D1R神經(jīng)元的活動是否與其上游同步，研究者采用了雙色多通道光纖記錄，同時將不同激發(fā)波長的鈣熒光探針分別注射到紋狀體或者PFC/MD。與單色多通道光纖記錄結(jié)果一致，紋狀體D1R神經(jīng)元的鈣信號和PFC神經(jīng)元和MD神經(jīng)元的鈣信號在清醒時均增加，在NREM睡眠時均降低。相關(guān)性分析表明，這些腦區(qū)間的神經(jīng)活動高度同步。為了研究PFC和MD神經(jīng)元抑制后對大腦狀態(tài)和紋狀體D1R神經(jīng)元活動的影響，研究者采用了化學(xué)遺傳學(xué)抑制PFC或MD的神經(jīng)元的活動，并利用光纖記錄系統(tǒng)記錄紋狀體D1R神經(jīng)元的活動。結(jié)果顯示，抑制PFC神經(jīng)元的活性導(dǎo)致覺醒減少以及NREM睡眠增加，同時，紋狀體D1R神經(jīng)元鈣信號的峰值和頻率降低；抑制MD神經(jīng)元活性清醒時間顯著降低，紋狀體D1R神經(jīng)元鈣信號的峰值和頻率也顯著降低。這些研究結(jié)果表明，紋狀體D1R神經(jīng)元、PFC神經(jīng)元和MD神經(jīng)元的鈣離子活動與睡眠和覺醒過程中的波動高度同步，且紋狀體D1R神經(jīng)活動受PFC和MD神經(jīng)傳入的調(diào)節(jié)。

4. 激活皮質(zhì)-紋狀體、丘腦-紋狀體和黑質(zhì)-紋狀體的神經(jīng)投射均能誘發(fā)覺醒

為了研究PFC、MD和SNc對的背側(cè)紋狀體神經(jīng)傳入各自在清醒轉(zhuǎn)變中的貢獻(xiàn)。研究者利用光遺傳技術(shù)分別激活PFC、MD和SNc神經(jīng)元在背側(cè)紋狀體的末梢。對末梢進(jìn)行激活均降低了腦電波Delta功率，并增加了肌電強(qiáng)度和清醒的概率。激活背側(cè)紋狀體中PFC或MD神經(jīng)元末梢導(dǎo)致小鼠從NREM睡眠到覺醒的過渡潛伏期縮短，且呈刺激頻率依賴性。在1、5、10、20和30 Hz的光刺激下，激活紋狀體中PFC神經(jīng)元末梢小鼠從NREM睡眠到覺醒的潛伏期分別縮短了32%、55%、88%、90%和98%。在1、5、10、20和30 Hz的光刺激下，激活紋狀體中MD神經(jīng)元末梢小鼠從NREM睡眠到覺醒的潛伏期分別縮短了16.8%、33.3%、78.7%、80.4%和66.7%。激活紋狀體中SNc神經(jīng)元末梢小鼠從NREM睡眠到覺醒轉(zhuǎn)變的潛伏期減少，但是沒有刺激頻率依賴性。接下來，研究者分析了每個投射的喚醒促進(jìn)效果。皮質(zhì)-紋狀體投射的喚醒促進(jìn)作用最 強(qiáng)，黑質(zhì)-紋狀體投射的喚醒促進(jìn)作用最弱?？傊せ钇べ|(zhì)-紋狀體、丘腦-紋狀體或黑質(zhì)-紋狀體的投射足以引起覺醒。

5. 紋狀體D1R神經(jīng)元通過下游的EP和SNr區(qū)域控制覺醒

為了闡明紋狀體D1R神經(jīng)元下游腦區(qū)在調(diào)控覺醒的作用，研究者在紋狀體中條件性表達(dá)了光通道蛋白ChR2，并在紋狀體的下游區(qū)域E P或SNr分別埋入光纖。在NREM睡眠期間，激活EP或SNr中紋狀體末梢導(dǎo)致腦電波Delta功率降低，肌電張力增加。激活紋狀體-EP投射或紋狀體-SNr投射均會增加了覺醒的概率，并降低了NREM睡眠到覺醒的潛伏期。這些結(jié)果表明，光遺傳激活源自紋狀體D1R神經(jīng)元的紋狀體-EP投射或紋狀體-SNr投射均能引起覺醒的。

6. 抑制紋狀體D1R神經(jīng)元可減少覺醒

最后，研究者利用化學(xué)遺傳學(xué)的方法來抑制紋狀體D1R神經(jīng)元活性，來檢測它們對睡眠-覺醒狀態(tài)的控制作用。在小鼠活動期抑制紋狀體D1R神經(jīng)元活性，NREM睡眠在給藥后3小時內(nèi)顯著增加（66.1%），清醒時間顯著減少（28.9%）。這些結(jié)果表明，紋狀體D1R神經(jīng)元的抑制增加了NREM睡眠，并減少了覺醒。

總結(jié)

本研究作者發(fā)現(xiàn)紋狀體D1R神經(jīng)元的激活可誘導(dǎo)NREM睡眠向清醒狀態(tài)的瞬間轉(zhuǎn)換，且紋狀體D1R神經(jīng)元在清醒狀態(tài)下更加活躍。紋狀體D1R神經(jīng)元的活動與投射到紋狀體的皮質(zhì)或丘腦神經(jīng)元的活動是同步的。激活皮質(zhì)-紋狀體、丘腦-紋狀體、黑質(zhì)-紋狀體，或者紋狀體-EP、紋狀體-SNr的神經(jīng)投射，會讓動物立即從NREM睡眠向覺醒的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。紋狀體D1R神經(jīng)元的上下游構(gòu)成了一個控制覺醒的上下回路。該研究的結(jié)果揭示了一個通過紋狀體D1R神經(jīng)元調(diào)節(jié)覺醒的神經(jīng)環(huán)路，為疾病相關(guān)的睡眠障礙治療提供了新策略。

亮點(diǎn)研究方法

這項(xiàng)工作利用了光遺傳學(xué)、光纖記錄以及在體腦電肌電記錄等技術(shù)揭示了紋狀體D1R神經(jīng)元調(diào)節(jié)覺醒的神經(jīng)環(huán)路。瑞沃德神經(jīng)科學(xué)研究解決方案提供貫穿動物疾病模型構(gòu)建、檢測和評估、調(diào)控機(jī)制研究的全流程產(chǎn)品和服務(wù)，覆蓋該研究中涉及的光遺傳學(xué)、光纖記錄、在體腦電肌電記錄、免疫組化等所有研究工作。在該項(xiàng)研究工作中，瑞沃德提供了用于病毒注射和顱腦手術(shù)的腦立體定位系統(tǒng)，確保相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作能夠精確完成。截止目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外 100 多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全 球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全 球科研人員發(fā)表SCI文章12000+，在行業(yè)內(nèi)得到廣泛認(rèn)可。