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  CF奇藝會(huì)員賬號(hào) 2008-06-19 00:00:00

  dische比色法又稱硫酸咔唑法，咔唑比色法 1 材料與儀器 0.1% 咔唑試液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均為化學(xué)純，枸杞多糖樣品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本課題組提供。722分光光度計(jì)。 2 方法與結(jié)果 2.1 常用的硫酸-咔唑法 2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取干燥的單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，定容于25 mL容量瓶中。然后準(zhǔn)確量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于帶塞試管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL濃硫酸，搖勻后，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出后冷至室溫，各管加0.2 mL咔唑液，在室溫下保持2 h，測(cè)定吸收度(530 nm)，以濃度對(duì)吸收度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2.1.2 測(cè)定各單糖在530 nm處的檢測(cè)響應(yīng)：分別準(zhǔn)確吸取各種單糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，補(bǔ)水至1 mL用2.1.1項(xiàng)下方法測(cè)得其吸收值，結(jié)果如表1。 表1 咔唑法測(cè)定時(shí)各單糖在530 nm處的吸收值 Gal Glc Man Xyl Ara Rha Fru GalA GlcA 0.0493 0.1018 0.0503 0.0840 0.0251 0.0140 0.1245 0.2603 0.2498 上述結(jié)果表明，用咔唑法測(cè)定時(shí)，天然多糖化合物中常見(jiàn)的各種中性單糖在530 nm處也均有程度不同的吸收。 2.2 各單糖濃度與咔唑法測(cè)定時(shí)在530 nm處吸收值的線性關(guān)系：以常用咔唑法(參考2.1.1)測(cè)定各單糖吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線(其中GalA和GlcA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為精確稱取干燥的糖醛酸10 mg溶于100 mL容量瓶)，其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)如下。 Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996) Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993) Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998) Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997) Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960) Rha 吸收值基本保持不變 GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998) GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999) 上述結(jié)果可知，各中性單糖在0.04～0.32 mg/mL范圍內(nèi)、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范圍內(nèi)各單糖濃度與咔唑法檢測(cè)吸收值呈線性。 2.3 定量考察各中性單糖對(duì)咔唑法測(cè)定糖醛酸含量的影響 2.3.1 分別準(zhǔn)確量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性單糖溶液(10 mg/25 mL)，分別補(bǔ)水至1 mL，按咔唑法測(cè)其吸收值。 2.3.2 分別準(zhǔn)確量取各中性單糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分別補(bǔ)水至1 mL，按咔唑法測(cè)其吸收值。得數(shù)據(jù)如表2。 表2 各種中性單糖對(duì)糖醛酸影響的定量考察結(jié)果 A530 加入標(biāo)準(zhǔn)中性糖體積(mL) A530 加入標(biāo)準(zhǔn)中性糖體積(mL) 0.0 0.4 0.6 0.0 0.4 0.6 GalA+Glc 0.2738 0.3732 0.3920 GlcA+Glc 0.2438 0.3506 0.4043 Glc 0.0000 0.1017 0.1377 Glc 0.0000 0.1183 0.1741 (GalA+Glc)Glc 0.2738 0.2715 0.2543 (GlcA+Glc)Glc 0.2438 0.2323 0.2302 GalA+Gal 0.2549 0.3059 0.3495 GlcA+Ga1 0.2603 0.3143 0.3406 Gal 0.0000 0.0513 .0914 Gal 0.0000 0.0473 0.1051 (GalA+Gal)Gal 0.2549 0.2546 0.2584 (GlcA+Gal)Gal 0.2603 0.2670 0.2355 GalA+Man 0.2636 0.3152 0.3100 GlcA+Man 0.2403 0.3050 0.3101 Man 0.0000 0.0463 0.0552 Man 0.0000 0.0533 0.0854 (GalA+Man)Man 0.2636 0.2636 0.2548 (GlcA+Man)Man 0.2403 0.2517 0.2247 GalA+Xyl 0.2692 0.3455 0.3837 GlcA+Xyl 0.2600 0.3432 0.3710 Xyl 0.0000 0.0759 0.1275 Xyl 0.0000 0.084 0.1072 (GalA+Xyl)Xyl 0.2692 0.6296 0.2562 (GlcA+Xyl)Xyl 0.2600 0.2592 0.2638 GalA+Rha 0.2218 0.2400 0.2223 GlcA+Rha 0.2204 0.2370 0.2215 Rha 0.0000 0.0090 0.0170 Rha 0.0000 0.0100 0.0120 (GalA+Rha)Rha 0.2218 0.2310 0.2063 (GlcA+Rha)Rha 0.2204 0.2270 0.2095 GalA+Fru 0.2444 0.3721 0.4432 GlcA+Fru 0.2204 0.3585 0.4335 Fru 0.0000 0.1345 0.2191 Fru 0.0000 0.1103 0.2097 (GalA+Fru)Fru 0.2444 0.2376 0.2241 (GlcA+Fru)Fru 0.2204 0.2482 0.2338 GalA+Ara 0.2551 0.2678 0.3125 GlcA+Ara 0.2360 0.2619 0.28885 Ara 0.0000 0.0072 0.0539 Ara 0.0000 0.0254 0.0558 (GalA+Ara)Ara 0.2551 0.2606 0.2586 (GlcA+Ara)Ara 0.2360 0.2365 0.2327 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品的吸收值隨中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而樣品吸收值與中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。 2.4 改進(jìn)的硫酸-咔唑法：根據(jù)2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出一種改進(jìn)的硫酸-咔唑法測(cè)定糖醛酸含量的方法，即樣品的吸收值減去中性糖的吸收值為樣品的吸收值。 2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 溶液1.準(zhǔn)確量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補(bǔ)水至1 mL。 溶液2.準(zhǔn)確量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補(bǔ)水至1 mL。 溶液3.準(zhǔn)確量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補(bǔ)水至1 mL。 中性單糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補(bǔ)水至1 mL。 2.4.2 方法改進(jìn)前后糖醛酸測(cè)定結(jié)果的比較：上述中性單糖溶液按咔唑法測(cè)定在530 nm處的吸收值為0.0442。 表3所列結(jié)果表明，改進(jìn)的咔唑法所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)溶液中糖醛酸吸收值與實(shí)際測(cè)定值基本一致，因此這種改進(jìn)的硫酸-咔唑法在測(cè)定各種樣品中糖醛酸的含量時(shí)，排除了樣品中中性糖對(duì)測(cè)定的影響，因而要比常用的硫酸-咔唑法準(zhǔn)確。 表3 不同方法的糖醛酸測(cè)定結(jié)果 溶液1 溶液2 溶液3 咔唑法測(cè)定值 0.1497 0.2482 0.3628 改良咔唑法測(cè)定值 0.1055 0.2040 0.3186 糖醛酸實(shí)際值 0.1092 0.2058 0.3207 注：改進(jìn)的咔唑法測(cè)定值為常用咔唑法測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)配制溶液中中性單糖吸收值(0.0442)之差。 2.5 改進(jìn)的咔唑法測(cè)定糖醛酸實(shí)例：從枸杞子中分離得到的多糖樣品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量測(cè)定，具體操作如下： 2.5.1 樣品中中性糖吸收值的測(cè)定：要求得樣品中中性糖對(duì)檢測(cè)的吸收干擾值，首先必須知道其中中性糖的含量和組成比。根據(jù)蒽酮-硫酸法〔4〕可測(cè)得中性糖的含量。組成比的測(cè)定需先將樣品全水解〔5〕，然后再用HPLC或GC測(cè)得樣品中各中性單糖的組成比。以此稱取各種相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中性單糖配成混合液，然后取1 mL溶液于帶塞試管中，然后按2.1.1所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作，測(cè)得其吸收值。 2.5.2 樣品的吸收值測(cè)定：按咔唑法(方法同2.1.1)，測(cè)得樣品吸收值(注：樣品中中性糖濃度應(yīng)在其線性范圍內(nèi))。 2.5.3 樣品中糖醛酸含量的測(cè)定：樣品中糖醛酸的吸收值為樣品吸收值與中性糖吸收值之差，再根據(jù)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的回歸方程，計(jì)算出該樣品中糖醛酸含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。 表4 常用的與改進(jìn)的咔唑法測(cè)定糖醛酸含量結(jié)果的比較 糖醛酸含量(%) 多糖樣品 常用咔唑法 改進(jìn)咔唑法 LbGP3 5.3 3.4 LbGP4 10.4 6.4 LbP1 8.8 5.9 LbP2 8.1 6.7 LbP3 8.7 5.7 從表4結(jié)果可以看出常用咔唑法測(cè)定糖醛酸的含量其值偏高。 3 討論 在咔唑法所規(guī)定的測(cè)定波長(zhǎng)下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影響糖醛酸含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。為此我們對(duì)7種不同的中性糖分別進(jìn)行了考察，測(cè)得其濃度與吸收值的線性范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Xyl，Man，Glc，Gal，F(xiàn)ru分別找到了各自的線性范圍，Rha隨著濃度的改變其吸收值基本保持不變，Ara較難判斷。各種單糖線性范圍的測(cè)得，不僅證實(shí)了中性糖的存在對(duì)咔唑法測(cè)定糖醛酸的結(jié)果產(chǎn)生干擾，而且為提出一種比常用咔唑法準(zhǔn)確性高的糖醛酸測(cè)定方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 用咔唑法測(cè)定各種中性單糖對(duì)糖醛酸影響的定量考察實(shí)驗(yàn)表明，糖醛酸和各中性單糖在其各自的線性范圍內(nèi)取樣，樣品的吸收值與中性糖吸收值之差與不含中性糖的糖醛酸實(shí)際測(cè)得吸收值基本一致。

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