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  惟惜戀鬼飄飄 2017-10-26 00:00:00

  通變性劑破碎細胞或者組織經(jīng)氯仿等機溶劑抽提RNA再經(jīng)沉淀洗滌晾干溶解由于RNA酶處隨能RNA降解所實驗需要注意稍疏忽前功盡棄0T3z(F&_，D6c%^"h6YA6_RNA提取般步驟-O:Y+x$p#s8U4M9S所RNA提取程都五關(guān)鍵點即：品細胞或組織效破碎；效使核蛋白復(fù)合體變性；內(nèi)源RNA酶效YZ；效RNADNA蛋白混合物離；于糖含量高品牽涉糖雜質(zhì)效除其關(guān)鍵YZRNA酶性RNA提取目前階段主要采用兩種途徑:提取總核酸再用氯化鋰RNA沉淀；直接酸性條件抽提酸性DNA與蛋白質(zhì)進入機相RNA留水相第種提取導(dǎo)致量RNA丟失目前該使用頻率已低(O(g;^+K)f+i&]%P實驗步驟：*l&d6s5e(q1F(g2|j，^0s破碎組織→離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA6D8}.Q;Y，g*X1、破碎組織滅RNA酶同步進行用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織加入β-MEYZRNA酶性"s%f，`0[1d*m!]0e2、離RNA般用酚、氯仿等機溶劑加入少量異戊醇經(jīng)步離RNA般布于層與蛋白層&X.P)i)Y;L#u/[3、沉淀RNA般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇2@0d&z7?+i，g1@4、洗滌RNA使用70％乙醇洗滌避免RNA洗掉步省掉洗滌晾干或者烤干乙醇能于干燥否則易溶解3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA般使用TE;L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫防止痕量RNase污染富含RNase品（胰臟、肝臟）離RNA需要貯存甲醛保存高質(zhì)量RNA于期貯存更鼠肝臟提取RNA水貯存星期基本降解鼠提取RNA水保存3仍保持穩(wěn)定另外度于4kb轉(zhuǎn)錄本于痕量RNase降解比轉(zhuǎn)錄本更敏增加貯存RNA品穩(wěn)定性RNA溶解離甲酰胺存于-70℃用于保存RNA甲酰胺定能含降解RNA雜物源于胰臟RNA至少甲酰胺保存準備使用RNA使用列沉淀RNA：加入NaAc至0.3M12，000×g離5鐘&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化鋰提取總RNA："u;}'I!r'^'^&l本用高濃度尿素變性蛋白并YZRNA酶用氯化鋰選擇沉淀RNA其特別適合于量品提取少量組織RNA具快速簡潔處存少量DNA污染及RNA率高，RNA片斷丟失缺陷#~*S:}9`*r4Z3P試驗試劑："d$r6Q+_.I8Q1、氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L濾滅菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、懸浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6)，1mM?EDTA(pH8，0)，0.5%SDS】!m8Q4R，]&y:b#`7d試驗步驟：7[6?$`*};o7_Z'{1、于量組織或細胞則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液勻槳器高速勻槳2鐘；于少量細胞（107細胞/ml）則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳并轉(zhuǎn)移至Eppendof管&Y)b:E，Q"l/^Q:\$s2、勻槳液0－4℃放置412000g離30鐘x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉淀加入原勻槳液1/2體積氯化鋰－尿素溶液重復(fù)步驟2)y-x)S0K9y6j，e4、沉淀用原勻槳液1/2體積氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶加入等體積酚/氯仿/異戊醇室溫放置15－30鐘并搖混勻4000g離5鐘3d2v'i1~(~*D5、取層水相加1/10倍體積3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積乙醇－20℃放置15000g離L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉淀真空干燥3};r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉淀RNA裝于－70℃保存0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－熱酚6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本適合于病毒RNA提取*I(i+b#r!K試驗試劑：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（終濃度50ug/ml），J5pl6V/t7[/I2、2×緩沖液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h，p]y+\$Z)O試驗步驟：#W3v8G1[$]5y1、提純病毒液加入等體積緩沖液、蛋白酶K，37℃40-50鐘-K0p/E'G0M#Q-z7n，{#d2、加入等體積65℃預(yù)熱酚溶液輕徭，65℃保溫5鐘再輕徭w!`;W(~，E:i3^3、離取清氯仿抽提，|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4、取層水相加1/10倍體積3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積乙醇－20℃放置15000g離(10000g，10min)7[/w，h2d6U$k5、70％乙醇洗沉淀真空干燥%A5Y;{(w%]3a*y，Oe)P6、RNA溶解液溶解沉淀RNA裝于－70℃保存植物RNA提取程難點相應(yīng)策植物RNA提取程難點相應(yīng)策)o5B7d/Q3_酚類化合物干擾及策：a9D*Z3K?7W許植物組織特別植物實（蘋、櫻桃、李、葡萄等）樹木類植物富含酚類化合物酚類物質(zhì)含量隨著植物增加幼嫩植物材料更容易提取RNA外針葉類植物針葉酚含量比落葉植物葉要高植物材料勻漿酚類物質(zhì)釋放氧化使勻漿液變褐色并隨氧化程度增加加深現(xiàn)象稱褐化效應(yīng)（browningeffect）氧化酚類化合物（醌類）能與RNA穩(wěn)定結(jié)合影響RNA離純化Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取難易程度與材料酚類物質(zhì)總量間并相關(guān)性認所酚類化合物都影響RNA提取般認所謂縮合鞣質(zhì)即聚合羥基黃酮醇類物質(zhì)（原花色素類物質(zhì)）影響RNA提取類化合物目前除酚類化合物般途徑提取初始階段防止其氧化再其與RNA9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚類化合物氧化："v;y，a4k7n/Z1、原劑：般提取緩沖液加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸防止酚類物質(zhì)氧化提取液(-巰基乙醇濃度高達2％(-巰基乙醇等打斷酚氧化酶二硫鍵使失Su等認夜沉淀RNA加入(-巰基乙醇（終濃度1％）防止程酚類化合物氧化硼氫化鈉（NaBH4）種原醌原劑用處理提取緩沖液褐色消減醌類化合物原酚化合物&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合劑：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO－N＝基強結(jié)合酚化合物能力其結(jié)合能力隨著酚化合物芳環(huán)羥基數(shù)量增加加強原花色素類物質(zhì)含許芳環(huán)羥基與PVP或溶性PVPP形穩(wěn)定復(fù)合物使原花色素類物質(zhì)能酚氧化酶底物氧化并抽提步驟除用PVP除酚pH值重要影響素pH8.0PVP結(jié)合酚能力迅速降低〔11〕原花色素類物質(zhì)量較單獨使用PVPP除所類化合物需要與其結(jié)合使用p%N0w/t7r3、Tris-硼酸：提取緩沖液含Tris-硼酸（pH7.5）其硼酸與酚類化合物依*氫鍵形復(fù)合物YZ酚類物質(zhì)氧化及其與RNA結(jié)合十效所Lбpez-Gбmez等提取緩沖液再加入其原劑Tris-硼酸濃度高（＞0.2M）則影響RNA收率#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）：原花色素類物質(zhì)與BSA間產(chǎn)類似于抗原－抗體間相互作用形溶性或溶性復(fù)合物減原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合機提高RNA產(chǎn)量BSA與PVPP結(jié)合使用提取效更由于BSA往往含RNase使用要加入肝素YZRNase性)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮：Schneiderbauer等用-70℃丙酮抽提冷凍研磨植物材料效云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物植物材料離高質(zhì)量RNA@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚類化合物除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通Li+或Ca2+沉淀RNA未氧化酚類化合物除與PVP、溶性PVPP或BSA結(jié)合酚直接通離除掉或苯酚、氯仿抽提除Manning利用高濃度2-丁氧乙醇（50％）沉淀RNA酚溶解于2-丁氧乙醇除用含50％2-丁氧乙醇緩沖液洗滌RNA沉淀除殘留酚認即使酚氧化其氧化產(chǎn)物仍溶解高濃度2-丁氧乙醇溶液除需再用NaBH4處理5C6Y8a1SV:`2~糖干擾及策：6I-b3R4~$T&O糖污染提取植物RNA遇另棘手問題植物組織往往富含糖糖許理化性質(zhì)與RNA相似難除糖同RNA裹攜走造RNA產(chǎn)量減少；沉淀RNA產(chǎn)糖凝膠狀沉淀種含糖RNA沉淀難溶于水或溶解產(chǎn)粘稠狀溶液由于糖YZ許酶性污染糖RNA品用于進步物研究規(guī)通SDS-鹽酸胍處理部除些糖；高濃度Na+或K+離存條件通苯酚、氯仿抽提除些糖；通LiCl沉淀RNA部糖留清液即使通些步驟仍發(fā)現(xiàn)相糖與RNA混雜起所需要用更效解決植物RNA離純化糖污染問題7['X/e，d8x(B-p(|9C&n用低濃度乙醇沉淀糖除糖效較RNA提取液或溶液緩慢加入水乙醇至終濃度10％～30％使糖沉淀RNA仍保留于溶液般都植物材料勻漿液加入乙醇Lewinsohn等裸植物木質(zhì)莖提取RNA勻漿清液加入乙醇至終濃度10％沉淀糖Tesniere等葡萄漿組織提取RNA用CsCl超離乙醇沉淀RNA溶液加入終濃度30％乙醇沉淀糖進步純化RNA品!i5b5m*z9G8M4~-N/D另用醋酸鉀沉淀糖Bahloul等提取云杉組織RNA勻漿清液加入1/3體積5M醋酸鉀（pH4.8）溶液沉淀糖；Ainsworth提取酸模植物花組織RNA加入1/5體積5M醋酸鉀（pH4.8）溶液Hughes等提取棉花葉花粉RNA加1/3體積8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液勻漿液除糖等雜質(zhì)提取某些植物材料RNA述兩種結(jié)合使用Lбpez-Gбmez等提取芒皮RNA勻漿液加入0.25體積水乙醇0.11體積5M醋酸鉀溶液除糖雜質(zhì)Su等除褐藻糖單獨使用乙醇或醋酸鉀都效兩者結(jié)合使用效佳6c9|5q1b9[5l1s+nFang等認緩沖液含高濃度NaCl助于除糖Chang等提取松樹RNA緩沖液NaCl濃度2.0M1.0M通氯仿抽提乙醇沉淀RNARNA與糖離Manning胡蘿卜種等材料苯酚提取清液稀釋調(diào)節(jié)Na+離濃度至80mM加入0.4體積2-丁氧乙醇沉淀除糖3B1h#M'{+{0U%U，K2@，v蛋白雜質(zhì)影響及策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白質(zhì)污染RNA品重要素由于RNase酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)要獲完整、高質(zhì)量RNA必須效除蛋白雜質(zhì)規(guī)冷凍條件研磨植物材料YZRNase等性；提取緩沖液含蛋白質(zhì)變性劑苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等勻漿使蛋白質(zhì)變性凝聚；利用蛋白酶K降解蛋白雜質(zhì)進步用苯酚、氯仿抽提除蛋白質(zhì)'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA高氯酸鈉溶液溶解度同離70％高氯酸鈉溶液RNA溶解度于蛋白質(zhì)溶解度部蛋白質(zhì)沉淀接著離清液加入兩倍體積水乙醇RNA能沉淀能溶于70％高氯酸鈉溶液殘留蛋白質(zhì)仍留清液除絕部蛋白質(zhì)3qe/\*I"A&@級代謝產(chǎn)物影響及策：:N3|)NfK#n;p'f6h0J2A0{植物組織提取高質(zhì)量RNA另難點許高等植物組織尤其熟組織能產(chǎn)某些水溶性級代謝產(chǎn)物些級代謝產(chǎn)物容易與RNA結(jié)合并與RNA共同抽提阻礙具物性RNA離能確定些級產(chǎn)物具體物質(zhì)所目前沒特殊解決問題Baker等綜合Hughes等選擇性沉淀、Chirgwin氯化銫梯度離Iversen等RNA收純化松樹種、熟松樹針葉等植物組織RNA(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由于植物組織特別高等植物組織細胞內(nèi)外組復(fù)雜性使植物組織RNA提取相于其物材料說要困難實踐經(jīng)發(fā)現(xiàn)即使同種植物同組織其RNA提取同；含某種干擾素同植物材料其適用RNA提取能同；即使同種植物同種組織材料源于同基型植株其RNA提取能所于某植物或其組織說其相應(yīng)RNA提取必需經(jīng)摸索實踐才能確立#S0a#G7L3S&A隨著植物物研究領(lǐng)域拓寬肯定說作其研究基礎(chǔ)植物材料RNA提取程現(xiàn)新難點隨著斷探索經(jīng)驗積累科工作者定迅速解決些難點植物物發(fā)展鋪平道路植物RNA提取些特殊植物RNA提取些特殊$e*[2U(E%h'[酚類植物RNA提取：!j!d，]2V(R!B&o蘋棉花等酚類植物提取RNA用TRIZOL般提驗證效，提取RNA純度特別高，用作northern足夠6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t實驗試劑：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH調(diào)至8.0，定至200ml，加200ulDEPC融解.*j)s;t2@)t4W'F試驗步驟：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml離管用液N2冷凍吼加入0.1g品，立即加入500ul酚氯仿，再加入500ul提取buffer，劇烈振蕩1-2min，冰放置5min"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm離15min，清轉(zhuǎn)入新管，加氯仿異戊醇抽提)H'L7d#d"y8@3、取600ul異丙醇，-20度沉淀20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm離10min!I.Y.\8b7A5、沉淀用70度乙醇洗k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min"A;y#}'F(`5}6I+N!x7、沉淀晾干，溶于30ulDEPC水;^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^銀杏等木本裸植物RNA提取：&Ai&V!H0`?6R銀杏、香機等木本裸植物酚類糖等物質(zhì)含量較RNA離純化干擾嚴重影響提取RNA質(zhì)量產(chǎn)量給相關(guān)物實驗進行帶阻礙目前RNA提取采取規(guī)Trizol試劑盒、SDS等能提取銀杏RNAShujunChang等(1993)CTAB提取RNA質(zhì)量較差降解十嚴重其提取步驟進行改進質(zhì)量較高銀杏RNA品/s4i*Vk8S)x試驗試劑：!]!M(q#E7N3t;`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris溶于60mL水用濃鹽酸調(diào)至Ph8.0定容至lOOmL.用滅菌DEPC水溶解`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水?dāng)嚢枞芙庥肗aOH調(diào)pH至8.0定容至100mL;V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL，100mL水溶解即9i)@a'\&w+cp*g4、提取緩沖液(DEPC水處理):2%CTAB（蛋白質(zhì)變性劑）.2%PVPK30（除酚類物質(zhì)）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金屬鰲合劑）2.0MNaCL（除糖CTAB）配:2gCTAB，2gPVP，10mL1mol/Ltris，5mL500mMEDTA，11.7gNaCL，定容100mL)o+\5E!X;O#A(M+P8H*K9n0q5、亞精胺(提取加少量)（RNA酶YZ劑）#J9g6O/h(u'd6、4%0疏基乙醇(提取加)（除酚類物質(zhì)）'De，d(J.K$z!O9f7、氯仿異戊醇(24:1)（抽提蛋白質(zhì)）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉淀RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配:2.9gNaCL，0.25gSDS，0.5mL1Mtris，100uL500mMEDTA，pH8.0，定容至50mL.m5z+J3X0V&\6e7Y#R試驗準備：;_5z9}"f%q6t1、研缽玻璃器皿用錫紙包200℃向溫烘烤2或180*C高溫烘烤4;X7n3w，W2}9M2、塑料制品(槍離管)用新并且用報紙包121'C高壓滅菌滅菌40min或連續(xù)兩121'C高壓滅菌每滅菌20min用烘箱烘千;X*f+~，v7}.a3、所溶液配制加DEPC水使DEPCuJ濃度0.1%，37℃夜1211C高壓滅菌40min.(其Tris能用DEPC處理所Tris用DEPC處理水溶液滅菌配制))x&B，{%e"^&F:s0q試驗步驟："Y6U+`2C*\4X2a#r【根據(jù)文獻(ShujunChang，1993)CTAB稍作改進】;F^+e9I#h/Q7m*A*]1、4mL提取液加入lOmL離管c卜650C水域加熱$D+?4w7\3J:w，M2、用液氮冷卻研缽研缽加入少量抗氧化劑PVP取1g低溫冷凍銀杏葉片迅速置于研缽加入液氮防止研磨程葉片融化充研磨立即加入預(yù)熱提取緩沖液用手搖功混勻6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃水域1min冷卻至室溫(N2@)U:S，{9M"e8f4、加入等體積(4mL)氯仿:異戊X17(2=L:1)混勻10000rpm，40C離10min(H6Po1y8p#?5、吸取清液加入等體積(4mL)仿:異戊醇(24:1)，混勻10000rpm，40C，離10min.{#k/z5r:x:v1x6、吸取清液加1/4體積IOMLiCL，混合4℃沉淀夜10000rpm離20min7xP4o6z1D![8}7、用槍吸干用500uLSSTE溶解沉淀轉(zhuǎn)1.5mL離管.加等體積氯仿:異戊醇混勻10000rpm，40C離10min，H2b7C1d*[6r4c8、離吸取取清液加兩倍體積水乙醉-70℃沉淀至少30min或200C沉淀2h"W*c'Y1P-t5K)^，`9、12000rpm，40C，離20min請用70%乙醇洗兩吹干沉淀1x，S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC處理水溶解沉淀RNA品8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用于電泳紫外檢測外其余RNA-70℃冰箱保存?zhèn)溆肣0o7V.]9x，{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提?。?r)r#s3~|.q1v.w試驗試劑：'C7Z1^)J&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol異硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME貯存4℃條件備用/a.I$E.RS%z2、RNA重懸液：2molLiCl10mmolNaAc調(diào)整終體積250mlpH5.2滅菌貯存4℃條件備用2u;J1S9V8a.j試驗步驟：)O/o，L#q-D8v)U1、取新鮮植物材料0.5~1g冷凍干燥必要加入0.2g砂起研磨加入10mlRNA抽提掖充混勻7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃條件8000rpm離10min層水相轉(zhuǎn)移至干凈離管加入等體積酚/氯仿抽提掖4℃條件8000rpm離10min1N:K+]3R"a7`3、清液轉(zhuǎn)移至干凈離管再用10ml氯仿洗清液1（加入10ml氯仿充混勻4℃條件8000rpm離10min.）$p+y，P/^-w/E'g"k0y:[4、清液轉(zhuǎn)移至另干凈離管加入1/10vol3molNaAc2vol冷水乙醇-80℃條件沉淀2:t&M8O1O!C-w5a5、4℃條件8500rpm離30min.棄清液沉淀重懸于RNA重懸液置于4℃條件19b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃條件8500rpm離10min.棄清液沉淀溶于適體積DEOC處理水檢測裝置于-70℃條件保存

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