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  暗中人shine 2016-08-17 11:07:41

  電泳后，核酸需經(jīng)染色才能顯色出帶型，常用以下核酸染色劑：1、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）Z常用的核酸熒光染料，可嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光.EB-DNA復合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠中的EB發(fā)出的熒光強度大10倍，因此無需洗凈背景即可清楚觀察核酸帶型.若EB背景太深，可將凝膠 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非結合的EB褪色，這 樣可檢查到10ng的DNA樣品，EB也可用于檢測單鏈DNA或RNA，但其對單鏈核酸的親和力相對較小，熒光產率也相對較低.在凝膠或電泳緩沖液中加入終濃度為0.5μg/ml的EB，染色可在電泳過程中進行，能隨時觀察核酸的遷移情況.但EB帶正電荷，嵌入堿基后增加了 核酸分子的剛性，使遷移率減慢，故不宜用于測定核酸分子量的大小，這時應在電泳后將凝膠浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min進行染色.EB見光 易分解，應于4℃避光保存，2、吖啶橙（acridine orange，AO）：吖啶橙可嵌入雙鏈核酸堿基對之間，在254nm紫外線激發(fā)下發(fā)出530nm的綠色熒光；還通過靜電與單鏈核酸的磷酸基結合，在254nm紫外線激發(fā) 下產生640nm的紅色熒光.因此可區(qū)分單鏈和雙鏈核酸，靈敏度分別為0.1μg和0.05μg.但吖啶橙的染色操作要求嚴格，應在 22℃，0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盤中用該緩沖劑4℃脫色過夜或22℃脫色1~2小時.3、銀（Ag+）試劑：Ag+與核酸形成穩(wěn)定復合物，然后用甲醛使Ag+還原成銀顆粒.AgNO3等試劑可使聚丙烯酰胺凝膠上的單鏈，雙鏈DNA及 RNA都染成黑褐色.銀染法的靈敏度比EB染色高200倍左右，比亞甲藍染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝膠中，能檢測出0.5ng的 RNA，其缺點是專一性不強，能與蛋白質，去污劑反應也產生褐色，而且對DNA的染色定量不準確.銀與DNA穩(wěn)定結合，對DNA有破壞作用，不適于DNA 片段回收的制備.4、亞甲藍（methylene blue）可將RNA染成藍色，但靈敏度不高，而且操作時間長.膠浸泡于0.02%的亞甲藍，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用凈水洗5~8h（反復換水），帶型肉眼可見，Z低檢測量為 250ng.

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