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  引堪怯184 2013-08-17 00:00:00

  1. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。 2. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。 3. 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強(qiáng)度和pH，應(yīng)常更新電泳緩沖液。 4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5μg的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定。當(dāng)加樣孔大時(shí)，樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大，否則會(huì)造成條帶淺甚至辯認(rèn)不清；反之則應(yīng)適當(dāng)減少加樣量，但是上樣量過(guò)多會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。 5. DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來(lái)決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。 回收率低或?yàn)榱? 1. 漂洗緩沖液中沒加入乙醇.在使用前應(yīng)確保乙醇已加入漂洗液PW中。 2. 吸附材料上有乙醇?xì)埩?洗脫時(shí)硅膠膜或硅膠樹脂上有漂洗緩沖液殘留，因含乙醇會(huì)降低洗脫效率。在洗脫前可通過(guò)再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，徹底去除漂洗緩沖液。 3. 洗脫緩沖液pH值偏低.DNA只在低鹽buffer中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris·Cl， pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。Z大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)。 4. 洗脫液加入位置不正確.洗脫液應(yīng)加在硅膠膜ZX部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面，達(dá)到Z大洗脫效率。 DNA質(zhì)量不好 洗脫產(chǎn)物含有乙醇?xì)埩?洗脫時(shí)硅膠膜或硅膠樹脂上有漂洗緩沖液殘留，會(huì)使洗脫產(chǎn)物中含有乙醇，影響下游操作。在洗脫前可通過(guò)再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，徹底去除漂洗緩沖液

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