研究背景

       連續(xù)流化學(xué)合成已成為化學(xué)領(lǐng)域的十大先進技術(shù)之一，酶催化由于具有較高的區(qū)域及立體選擇性引起越來越多的關(guān)注。熱穩(wěn)定性好的酶，可以利用3D生物打印技術(shù)以瓊脂糖為原料快速地生產(chǎn)具有生物催化作用的反應(yīng)器。

4-羥基二苯乙烯連續(xù)流合成

       來自卡爾斯魯厄理工學(xué)院生物研究所的Kersten S. Rabe團隊報道了利用3D打印技術(shù)生產(chǎn)具有生物催化作用的反應(yīng)器。研究人員首先將酶與瓊脂糖溶液混合制成生物墨水后冷卻，然后在8°C下儲存。使用3D打印機，在60°C下熔化生物墨水，并打印到冷卻基質(zhì)上，形成生物催化模塊。這些模塊被集成到連續(xù)流反應(yīng)器中，將底物溶液加入到反應(yīng)器中，進行連續(xù)流合成。

       4-羥基二苯乙烯是2,3-二氫苯并呋喃類藥物的重要前體，研究人員利用丙烯酸苯酯脫羧酶（PAD）催化對羥基苯丙酸，連續(xù)生成4-乙烯基苯酚。在串聯(lián)的第二步反應(yīng)中，酶催化產(chǎn)生的乙烯基苯酚，參與醋酸鈀催化的Heck反應(yīng)。以對香豆酸為原料合成了4-羥基二苯乙烯，總收率為14.7%（路線1）。

路線1：4-羥基二苯乙烯的合成

       研究人員首先研究了四種用于4-乙烯基苯酚生產(chǎn)的無輔助因子丙烯酸苯酯脫羧酶，并測試了它們對可分離式微反應(yīng)器的盤狀瓊脂糖模塊的封裝和直接3D打印的可行性（見下圖1）。

圖1. 3D打印可行性研究

       由于生物催化活性反應(yīng)器的打印需要在60°C下進行15 min的初始加熱，因此需要使用自然產(chǎn)生的耐熱酶或蛋白質(zhì)工程熱穩(wěn)定的酶來獲得耐熱酶。為了拓寬現(xiàn)有生物催化劑的范圍，確定合適的PAD酶，研究人員直接比較了四種不同酶在相同條件下的酶活性和熱穩(wěn)定性（見圖2）。

圖2 A）四種不同的PAD；B）以Z簡單的對-羥基苯丙烯酸和Z簡單的有取代基的對-羥基苯丙烯酸為底物進行活性測試；C）四種PAD的熱穩(wěn)定性范圍

       結(jié)果顯示，四種酶的活性在本文所研究的條件下（圖2B）處于相同的數(shù)量級，基于這一結(jié)果，研究人員將酶的熱穩(wěn)定性作為篩選的依據(jù)。在25℃下，以對香豆酸為底物測定酶活性，所產(chǎn)生的酶活性與孵化溫度的關(guān)系圖，可用于確定T50值，即初始酶活性仍保持50%時的溫度（圖2C）。結(jié)果顯示，EsPAD是Z耐熱的酶，以對香豆酸為底物的測試中酶活性Z高。

       為了進一步確認所得到的四種酶的T50值是對用于3D打印適用性預(yù)測的準(zhǔn)確性，用4種酶制備了瓊脂糖生物油墨，并打印出具有生物催化活性的反應(yīng)模塊(每個模塊含有97nmol酶)。通過使用流動反應(yīng)器裝置(圖3A)，以12.5mL/min的恒定流速向反應(yīng)器中加入0.125mM對香豆素酸溶液進行催化的脫羧反應(yīng)。

圖3 A）連續(xù)流反應(yīng)裝置；B）含有EsPAD的模塊轉(zhuǎn)化為78%的對香豆酸；C）50mL收集管及向反應(yīng)器加入底物溶液；D）4-乙烯基苯酚（上）/ 4-羥基二苯乙烯（下）

       收集反應(yīng)器流出的樣品，并用HPLC進行分析。正如T50結(jié)果所預(yù)測的，含有LpPAD、BmPAD或LbPAD的反應(yīng)器模塊中收集的樣品未檢測到4-乙烯基苯酚，然而在同樣條件下，含有EsPAD的模塊轉(zhuǎn)化了78%的對香豆酸（圖3B）。為了提高轉(zhuǎn)化率，將生物墨水中的酶濃度提高到100μM。在此反應(yīng)條件下，1 mM對香豆酸的轉(zhuǎn)化率可達98%。

       經(jīng)萃取、快速層析純化得到4-乙烯基苯酚（圖3D上），分離收率為54%。根據(jù)路線1所示的反應(yīng)，經(jīng)鈀催化的Heck反應(yīng)將純化的4-乙烯基苯酚與碘苯偶聯(lián)得到了 4-羥基二苯乙烯（圖3D下)，總收率約為15%。

實驗總結(jié)：

       研究人員利用酶催化的GX性，結(jié)合3D打印技術(shù)可以快速生產(chǎn)具有生物催化活性的微反應(yīng)器。

       以此生產(chǎn)的反應(yīng)器以香豆酸為原料進行了4-羥基二苯乙烯的連續(xù)流合成。

       該方法具有快速GX，反應(yīng)條件溫和的特點，給有機合成的研究開辟了一個新的研究方向。

參考文獻：Chem. Eur. J. 10.1002 / chem. 201904206