ELISA實驗操作要點：ELISA檢測做好這7步需謹(jǐn)慎

　　ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中為廣泛為靈敏的技術(shù)手段?？墒窃谛吕鲜植僮鬟^程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題，比如說花板，假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低。天津本生為您總結(jié)7步ELISA檢測實驗經(jīng)驗，做好這7步您就能得出的實驗結(jié)果。

　　1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，方法簡要的列出如下:

　　①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。

　?、谥愇镔|(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。

　?、坌》肿颖仨氁揽亢痛蟮牡鞍纵d體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

　　2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙/烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下終可不可以應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

　　3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。

　　4、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙/烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差，人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)除外)，洗的不徹底或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。

　　5、加抗體標(biāo)本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用PBS稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著色淺。

　　6、顯色：顯色系統(tǒng)又很多，我們一開始做的時候，要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。

　　7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如出現(xiàn)問題也好分析。

　　ELISA 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

　　ELISA各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。

　　一、標(biāo)本的采取和保存

　　可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。

　　血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。

　　二、試劑的準(zhǔn)備

　　按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。

　　三、加樣

　　在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。

　　四、保溫

　　在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。

　　ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

　　保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。

　　elisa實驗：怎么保存ELISA試劑盒?

　　(1)要留心避免出現(xiàn)嚴(yán)峻溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過氧化物的活性，因而，在以HRP為符號酶的ELISA試劑盒測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很簡單在溫育進(jìn)程中吸附于固相，然后與后邊參與的HRP底物反響顯色。

　　(2)樣本的收集及血清別離中要留心盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的成長，其所分泌的一些酶或許會對抗原抗體等蛋白發(fā)作分化效果;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作符號的測定方法發(fā)作非特異性攪擾。

　　(3)血清標(biāo)本如是以無菌操作別離，則可以在2～8℃下保存一周，ELISA試劑盒如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長期保存，應(yīng)在-70℃以下。

　　(4)冰凍保存的血清標(biāo)本須留心避免因停電等形成的重復(fù)凍融。ELISA試劑盒標(biāo)本的重復(fù)凍融所發(fā)作的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子發(fā)作損壞效果，然后引起假陰性效果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)留心，不要進(jìn)行劇烈振動，重復(fù)倒置混勻即可。

　　(5)標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所形成的的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉積后取上清檢測。Elisa試驗是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的試驗確診方法。因為其試劑安穩(wěn)、易保存，操作簡潔，效果判斷較客觀等要素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)查驗的各領(lǐng)域中。ELISA試劑盒是用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗體ELISA檢測。成長環(huán)境之中的有用因子和營養(yǎng)成分進(jìn)行更好的了解，確保這種血清原材料的成長活性和可靠性更高，以更加的品質(zhì)讓這種動物細(xì)胞培養(yǎng)的活性得到大幅度的提升;

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　　本生—ELISA試劑盒檢測注意事項匯總

　　以下是本生技術(shù)小編總結(jié)：影響ELISA檢測的關(guān)鍵因素，也是眾多ELISA 用戶在實驗中經(jīng)常遇到的問題及解決方案：

　　Q1：為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作?

　　A1：溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

　　Q2：為什么標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差?

　　A2：按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品;溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心，徹底收集粉末;確保標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解和混勻(大約10min)，然后再進(jìn)行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　Q3：ELISA實驗為什么必須設(shè)置復(fù)孔?

　　A3：為獲得更準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，強(qiáng)烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。

　　因為復(fù)孔檢測可以：

　　★計算平均值，確保實驗結(jié)果更準(zhǔn)確;

　　★解決實驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;

　　★計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。

　　Q4：為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?

　　A4：振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)專用96孔微孔板振蕩器。

　　孵育過程振蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過程更加完全，OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

　　具體操作請參見說明書或致電勁馬生物

　　Q5：何時終止ELISA反應(yīng)?

　　A5：ELISA實驗最終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成，在最合適的時間終止反應(yīng)是ELISA實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色不再變深，倒數(shù)2-3個濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色開始有淺藍(lán)色時，便需要終止反應(yīng);或者也可以根據(jù)最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來決定，OD620=0.9-0.95之間時即可終止。

　　Q6：為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時必須選用雙波長?

　　A6：首先，酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實驗采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾(標(biāo)本的濃度，干擾色等)。一般采用波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值最小，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此，雙波長測定，可最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

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　　Elisa實驗：Elisa如果加樣，有哪些小竅門!

　　ELISA實驗中，加樣 一定是繞不開的一環(huán)!ELISA測定操作非常簡單，一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

　　ELISA實驗中一般需要 4 次加樣，即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。

　　● 實驗室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會導(dǎo)致讀數(shù)差別，因此避免儀器帶來誤差。

　　● 加樣前，溶液充分混勻，加樣時不可90度向孔中滴加液體，否則會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

　　● 加樣品時，單孔用量要求：≥50ul/指標(biāo)，如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。

　　● 加樣時速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。

　　● 加樣時避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄。

　　● 每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個孔顯色時間相同。

　　● 加完顯色液后，放入一個可推拉的抽屜內(nèi)，就可以避光振蕩了。

　　| 加樣防錯小竅門

　　● 用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。

　　● 可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。

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