聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr在細(xì)胞生物學(xué)研究中有何應(yīng)用

976483947愛 2016-08-19 07:58:25 644 瀏覽

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af05522 2016-08-20 00:00:00

可用于基因工程中目的基因的獲取，擴(kuò)增目的基因

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小啦啦gg 2016-08-20 00:00:00

PCR技術(shù)能快速特異地在體外復(fù)制目的，理論上能將其量極微的（fg DNA）目的基因在較短的時間內(nèi)（1-2小時）擴(kuò)增到極易檢測的微克水平。PCR技術(shù)目前已經(jīng)成為人們獲得目標(biāo)基因的Z常用的方法之一。然而其基本原理并不復(fù)雜，主要包括模板DNA（目標(biāo)DNA）加熱變性；降溫后反應(yīng)混合物中特異性引物與單鏈DNA模板的復(fù)性；72℃條件下，Taq酶誘導(dǎo)引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一輪反應(yīng)，模板拷貝數(shù)都增加一倍，理論上n次循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物拷貝數(shù)為2n－1。但在PCR反應(yīng)后期由于底物的消耗，Taq酶活力的下降，PCRYZ物的增加，PCR反應(yīng)的指數(shù)形式逐漸轉(zhuǎn)化為線性形式進(jìn)入擴(kuò)增的平臺期，實際上30-35個循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)百萬倍。如果想再提高擴(kuò)增產(chǎn)物的量，可以將產(chǎn)物DNA再稀釋1000倍作為新的模板進(jìn)行第二輪的pcr擴(kuò)增，一般二次擴(kuò)增后的DNA數(shù)量已達(dá)到所有分子生物學(xué)操作的要求。一、變性，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的生物功能在于復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，加熱或在堿性條件下可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為DNA變性。解除條件后，變形的單鏈DNA可以重新結(jié)合起來，再形成雙鏈，稱之為DNA復(fù)性，又叫退火。DNA雙鏈離解一半時溫度稱為解鏈溫度（Tm）。不同DNA的解鏈溫度不同，取決于DNA中G-C與A-T的含量的區(qū)別。G-C間有三個氫鍵，A-T間有兩個氫鍵，因此G-C比例大的DNA片段解鏈溫度高，一般，G-C含量每增加1％，PCR變性溫度增加0.4℃。Tm范圍通常一般在85-95℃之間，PCR變性溫度選擇94℃，變性時間為30秒到2分鐘。

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一文帶你了解分子生物學(xué)研究技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

1、什么是PCR

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，其是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學(xué)技術(shù)。這種技術(shù)模擬體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，能將微量的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，在短時間內(nèi)獲得足夠的DNA，是分子生物學(xué)研究中不可缺少的一員。

2、標(biāo)準(zhǔn)PCR的過程

此項技術(shù)是模擬DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，在整個PCR過程中包含了變性——退火（復(fù)性）——延伸三個基本反應(yīng)步驟。

DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
退火（復(fù)性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

3、為什么要使用梯度PCR儀呢

梯度PCR儀是指一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件的儀器，因為不同的DNA片段其最適退火溫度不同，采用梯度PCR儀通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的最適退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行有效的擴(kuò)增。

在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。

使用普通的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增時，只能運行一個特定的退火溫度，當(dāng)目的基因的退火溫度不適時，就可能出現(xiàn)假陽性，影響實驗結(jié)果。而對于梯度PCR儀，不但可以作為普通PCR儀使用，也可以通過設(shè)置不同的溫度梯度（通常為12個梯度溫度），研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，有效降低或避免假陽性，同時在不理想的工作條件下擴(kuò)增出產(chǎn)物，既節(jié)約成本也提高了實驗效率。

適用于分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、食品科學(xué)和農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域，進(jìn)行分子克隆、基因表達(dá)分析、基因型鑒定、測序、病原微生物分析等實驗研究。

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2022-04-18 11:48:21 574 0