全部評(píng)論(2條)
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- goolring 2015-02-17 00:00:00
- 抽提方法 編輯 實(shí)驗(yàn)前方法/試劑的選擇 shou選方法是堿裂解法。如果有問題，或者是大質(zhì)粒 (>15 kb)，則用溫和的方法 SDS 裂解法。詳細(xì)情況見“分子克隆”。試劑盒幾乎都使用堿裂解法，所以都有一個(gè)通病，抽提大質(zhì)粒時(shí)效果不好。 關(guān)于堿裂解法 質(zhì)粒抽提Z常用的方法是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點(diǎn)。關(guān)于堿裂解法的原理，復(fù)旦大學(xué)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的網(wǎng)站有一篇專論，大家可以去看一下。這是一篇美文，非常有趣。文中提到了一個(gè)與幾乎所有能查到的資料不同的觀點(diǎn)，也是非常有啟發(fā)的。 當(dāng)然，堿裂解法也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性；不適合大質(zhì)粒的抽提。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長，這種變性就成為不可逆的了 (電泳時(shí)在超螺旋前面一點(diǎn)點(diǎn)，如果有一條帶，就是此變性的質(zhì)粒。)。所以，要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。 (似乎可以做這么一個(gè)推理：在堿性條件下，質(zhì)粒的兩條鏈從一點(diǎn)或者幾個(gè)點(diǎn)開始分開，隨著時(shí)間的延長，直到完全分開。理論上講，完全分開的兩條鏈要很快地配對(duì)復(fù)性，成功率肯定不可能是 的，而沒有完全分開的兩條鏈卻完全可能 配對(duì)復(fù)性。) 堿裂解法不適合大質(zhì)粒的抽提，原因也是因?yàn)樵摲椒ㄌ珓×遥钩菪壤^低。文獻(xiàn)推薦的抽提大質(zhì)粒的方法是溫和得多的方法，缺點(diǎn)是得率要低一些?，F(xiàn)在得問題是，大質(zhì)粒的拷貝數(shù)本來就低，如果抽提方法得率再不高的話，抽提起來就很費(fèi)力了。如果注意到在堿裂解法中，超螺旋比例隨著堿裂解時(shí)間的延長而降低，隨著粘稠度的增加而減低這個(gè)現(xiàn)象，完全可以使用堿裂解法來抽提大質(zhì)粒的：增加試劑的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分鐘內(nèi)就能變得很清澈；立即加入中和試劑。這個(gè)實(shí)驗(yàn)我們沒有做過，但 QIAGEN 抽提大質(zhì)粒用的就是堿裂解法。
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- zky914 2015-02-17 00:00:00
- 是啊，要輕柔的上下顛倒
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