4.6 凍干產(chǎn)品的貯藏與復(fù)水

4.6.1 真空或充氣包裝

已干燥產(chǎn)品是一種疏松的多孔物質(zhì)，有很大的內(nèi)表面積。如果暴露于空氣之中，就會(huì)吸收空氣中的水分而潮解，增加產(chǎn)品的殘余水分含量。其次，空氣中的氧、二氧化碳與產(chǎn)品接觸，一些活性基團(tuán)就會(huì)很快與氧結(jié)合產(chǎn)生不可逆的氧化作用。此外，空氣中如含有雜菌，還會(huì)污染產(chǎn)品。因此，在產(chǎn)品干燥后，能直接在真空箱內(nèi)密封，使之不與外界空氣接觸?，F(xiàn)在比較先進(jìn)的凍干機(jī)都具有這種功能。因此，凍干產(chǎn)品的貯藏應(yīng)該從第二階段干燥結(jié)束以后開(kāi)始。

由解吸等溫線可知，在平衡條件下，產(chǎn)品中吸附水分的量在給定溫度下是水蒸氣壓力的函數(shù)，如圖4-53所示。在給定溫度下，在很短的時(shí)間內(nèi)可近似認(rèn)為是平衡狀態(tài)，在第二階段的工作壓力應(yīng)該小于平衡蒸氣壓，例如，當(dāng)溫度為+40℃，預(yù)期殘余水分小于1%時(shí)，pch應(yīng)該為幾帕。如果產(chǎn)品（血漿）的溫度只有+20℃，則工作壓力應(yīng)該比1Pa還小。通常情況，延長(zhǎng)干燥時(shí)間不能降低殘余含水量——只有升高溫度才能降低殘余含水量。要想得到較低的含水量，吸濕性的產(chǎn)品應(yīng)防止在干燥室中再次吸入已被干燥除去的水分。如果使用小瓶，應(yīng)在干燥室中密封。如果是散裝的物料或食品，干燥后應(yīng)該往干燥室中充入干燥空氣或惰性氣體。在+20℃，相對(duì)濕度為70%時(shí)，空氣中的水分約為1.3×10-2gH20/L。往體積為200L的干燥室充入該氣體時(shí)，將引入2.6g的水蒸氣。如果干燥室中有300個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶裝有固體含量為10%的1cm3的物料，則殘余含水量將增加約9%。如果固體含量只有1%，則殘余含水量增加到90%。充入氣體的露點(diǎn)應(yīng)該與第二階段的最終壓力相對(duì)應(yīng)，例如，最終壓力為2Pa,氣體的露點(diǎn)應(yīng)為-55℃，最小應(yīng)為-50℃。

因此，凍干產(chǎn)品應(yīng)在二次干燥結(jié)束后采用真空或充氮?dú)獍b，包裝材料的滲透性差，貯藏運(yùn)輸過(guò)程應(yīng)避光。

4.6.2 凍干產(chǎn)品的復(fù)水

理論上，凍干制品復(fù)水后能恢復(fù)原有的性質(zhì)和形狀。實(shí)際上要讓凍干后的產(chǎn)品完全恢復(fù)原有的特性，不僅受冷凍干燥過(guò)程影響，復(fù)水條件也是很重要的，比如復(fù)水液，復(fù)水速率，復(fù)水溫度，復(fù)水率等都會(huì)影響復(fù)水后制品的特性。如人紅細(xì)胞、角膜等在凍干過(guò)程中，大部分水分都被除去，要恢復(fù)其基本生理功能，必須進(jìn)行復(fù)水，為細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)與體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境基本相符的條件。牛肉，方便米飯，牡蠣、海參等凍干的食品在食用的時(shí)候應(yīng)復(fù)水恢復(fù)其原有的形狀，色澤及口感等。咖啡、青霉素等藥品在使用的時(shí)候應(yīng)能速溶。不同的物料復(fù)水條件和過(guò)程都不一樣，通常用實(shí)驗(yàn)的方法確定。

4.5.2 凍干產(chǎn)品的質(zhì)量及其變化

假設(shè)凍干本身是在最優(yōu)條件下進(jìn)行的，而且在凍干過(guò)程結(jié)束時(shí)產(chǎn)品達(dá)到了預(yù)期的質(zhì)量，凍干產(chǎn)品在存儲(chǔ)過(guò)程，其質(zhì)量變化至少受三個(gè)因素的影響：殘余水分，存儲(chǔ)溫度及混合在包裝袋里的氣體。與其中一種因素有關(guān)的或在更多情況下與三種因素都有關(guān)的變化可分成以下四種情況：

①在與水分子的重組過(guò)程發(fā)生的變化和/或溶解性；

②干燥產(chǎn)品的化學(xué)反應(yīng)；

③產(chǎn)品生物-醫(yī)學(xué)活性的惡化；

④產(chǎn)品物理結(jié)構(gòu)的變化，例如：由非晶形轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠只蛉烤w結(jié)構(gòu)的形式。

通常發(fā)生的變化可由這幾種變化中的某幾種解釋。下面給出了幾個(gè)典型例子。

Liu和Langer證明BSA，卵清蛋白、葡萄糖、氧化酶和β—乳球蛋白在37℃時(shí)溶解性迅速減小，并且如果在已干產(chǎn)品中加入了30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）生理鹽水緩沖液，則在24h內(nèi)97%的產(chǎn)品將變?yōu)榉侨芙庑缘摹Ｓ捎谒侄鸬木奂瘹w因于分子間的S一S鍵。對(duì)于給定的白蛋白，如果RM為最優(yōu)值則可減少聚集。

Zhang等人研究了在keratonocyte增長(zhǎng)因子(KGF)重組過(guò)程重組介質(zhì)對(duì)形成聚集的影響。若干添加劑可使聚集明顯地減小，調(diào)節(jié)重組介質(zhì)離子的強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)也有類似的作用。優(yōu)化重組條件可增加蛋白質(zhì)可溶性的恢復(fù)；對(duì)于KGF，蛋白質(zhì)溶解性的恢復(fù)與本身的、單節(jié)顯性的組成有關(guān)。此外，Zhang等人還發(fā)現(xiàn)當(dāng)用純水重組時(shí)，白細(xì)胞素-2(Ⅰ)和核糖核酸酶（Ⅱ）在+45℃的溫度下存儲(chǔ)時(shí)聚集相當(dāng)大。如果在重組水中加入肝磷脂或磷酸鹽可明顯減少聚集的長(zhǎng)度。Shalaev等人研究了在RM<0.1%時(shí)，非晶形蔗糖對(duì)葡萄糖和果糖酸性催化轉(zhuǎn)化作用。即使RH=0.1%，在50℃凍干蔗糖時(shí)，例如帶有檸檬酸，也得經(jīng)受酸催化轉(zhuǎn)化，作者得出的結(jié)論是凍干帶有蔗糖的酸性物質(zhì)即使是RM很低也會(huì)產(chǎn)生能夠進(jìn)一步和其他成分起反應(yīng)的物質(zhì)。

Yoshika等人利用ONMR光錯(cuò)學(xué)研究了在存儲(chǔ)過(guò)程中β-牛乳糖間的反應(yīng)和水的遷移率有關(guān)。水分的增加也使自旋-晶格弛緩時(shí)間T?增加，相互之間的反應(yīng)與T?的關(guān)系比pH值的關(guān)系還要緊密。設(shè)想可能是水的增加使酶周?chē)乃倪w移增加，從而使酶的反應(yīng)增加。帶有少量水的凍干樣品，也表現(xiàn)出比根據(jù)pH值和水的遷移率估計(jì)的還要快的反應(yīng)速度，這可能是由凍干時(shí)所用的添加劑鹽引起的。Yoshika等人也使用了NMR光譜學(xué)，但用的是1H自旋-自旋獨(dú)緩時(shí)間T?。測(cè)得BSA和γ-血球素的T?是隨水合程度而變化的。凍干的BSA和BGG如果水分超過(guò)大約0.2%(g/g)蛋白質(zhì)，則對(duì)聚集變得敏感。蛋白質(zhì)質(zhì)子的T?在水分較低時(shí)就開(kāi)始增加，且隨水分的增加聚集也緊跟著增加。對(duì)于凍干的BGG，在水分>0.5g/g蛋白質(zhì)時(shí)蛋白質(zhì)質(zhì)子的聚集和T?都將減小。

Vromans和Schalks利用非晶形維庫(kù)溴銨研究了水敏性藥品的穩(wěn)定性。在制劑中其分解主要取決于水的活度αW，而不是水分的多少。賦形劑的玻璃化不僅有低溫保護(hù)作用，而且起穩(wěn)定作用。Cleland等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖和蛋白質(zhì)具有適當(dāng)?shù)姆肿颖嚷蕰r(shí)，在40℃可穩(wěn)定保存人類單克隆抗體重組細(xì)胞(ruhMAb HER2)33個(gè)月。360：1的摩爾比率可成功地穩(wěn)定蛋白質(zhì)。這比通常的制劑中所用的等滲濃度低3～4倍。Souillac等人比較了凍干和物理混合的h-Dnase、rh-GH和rH-IGF-1和甘露醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷的焓。對(duì)物理混合物，發(fā)現(xiàn)焓與蛋白質(zhì)的百分含量呈線性關(guān)系；對(duì)凍干的混合物此關(guān)系是非線性的。作者得出的結(jié)論是在凍干的混合物中蛋白質(zhì)和碳水混合物之間會(huì)直接發(fā)生反應(yīng)。

Hsu等人發(fā)現(xiàn)已包裝的產(chǎn)品也有可能發(fā)生分解。設(shè)想凍干結(jié)束時(shí)只具有單分子層的水，且不是均勻分布的，但是在有些位置分子可能連成串。在干燥和存儲(chǔ)過(guò)程這些水提供的保護(hù)以防止變性。這點(diǎn)是由基因技術(shù)產(chǎn)生的兩種產(chǎn)品證明的：太少的水，比單分子層還少，造成tPA和高鐵血紅蛋白在物理上的不穩(wěn)定，然而較高含量的水卻導(dǎo)致存儲(chǔ)過(guò)程生物上的不穩(wěn)定。

To和Flink以及van Scoik和Carstensen闡述了四種變化的例子：依To和FIink的觀點(diǎn)，非晶形到晶體的轉(zhuǎn)變或者是因?yàn)榇鎯?chǔ)溫度T(T>TC)太高，或者是因?yàn)槲樟怂＃ㄗⅲ狠^多的水增加了非晶形固體的流動(dòng)性，促進(jìn)了晶體的成核和增長(zhǎng)）。

Van Scoik和Carstensen交流了他們關(guān)于蔗糖晶體成核和增長(zhǎng)的經(jīng)驗(yàn)。討論了溫度和殘余水分這兩個(gè)成核參數(shù)，建議用添加劑可停止、延緩或加速成核。用來(lái)清洗裝有小瓶的干燥室的氣體和加入產(chǎn)品的包裝袋里的氣體的影響尚且不清楚。只是氧氣在多數(shù)情況下被排除。Spiess建議用干空氣存儲(chǔ)花椰菜和藍(lán)莓，然而胡蘿卜和辣椒粉應(yīng)該存儲(chǔ)在氧氣含量<0.1mgO?/g干物質(zhì)的氣體中。對(duì)于藥品，病毒或細(xì)菌，無(wú)法給出普遍的建議，由于CPA、添加劑的結(jié)構(gòu)、緩沖劑的影響都應(yīng)考慮。

所有氣體的純度也應(yīng)該做詳細(xì)說(shuō)明，由于一定量的雜質(zhì)對(duì)存儲(chǔ)特性有可能起決定性的作用，例如從瓶塞中解吸出的氣體。Greiff和Rightsel證明流行性感冒病毒在沒(méi)有CPA的情況下當(dāng)RM為1.6%時(shí)在氨中的傳染性保持得非常好。如果使用通常的存儲(chǔ)溫度，在氬中，傳染性減小大約10倍，在氧氣中減小20多倍。Corveleyn和Remon凍干了兩種不同的包含25mg二氫氯噻的藥片制劑。藥品用PVC/鋁塑包裝、聚偏二氯乙烯(PVDC)/鋁塑包裝、帶干燥劑的密閉容器和非密閉容器在60℃以三種RH，45、60和85%存儲(chǔ)。一個(gè)月后，除了包裝在PVDC/鋁塑包裝中的藥片以外，其余藥RM都由2.7%增加到6.8%。水分為7.2%的制劑崩塌。PVDC/鋁塑包裝中藥片的水分的增加或減少非常慢。用于包裝凍干藥片的材料沒(méi)有一種能阻止水分的吸收和結(jié)構(gòu)的崩塌。

4.1共晶點(diǎn)和熔融點(diǎn)溫度的測(cè)量

溶液的導(dǎo)電是靠帶電離子在溶液中定向移動(dòng)來(lái)進(jìn)行的。在溶液凍結(jié)過(guò)程中，離子的漂移率隨溫度的下降而逐漸降低，使電阻增大。只要還有液體存在，電流就可流動(dòng)。但一旦全部?jī)鼋Y(jié)成固體，帶電離子不能移動(dòng)，電阻就會(huì)突然增大。根據(jù)電阻由小突然變大這一現(xiàn)象，就可測(cè)出溶液的共晶點(diǎn)。反之，當(dāng)凍結(jié)物料的溫度升高時(shí)，物料的電阻值會(huì)突然減小，這一過(guò)程可用于測(cè)定物料的熔融點(diǎn)溫度。

4.1.1 簡(jiǎn)易自制測(cè)量裝置

東北大學(xué)自制的共晶點(diǎn)和熔融點(diǎn)測(cè)試裝置如圖4-1所示。物料的制冷和加熱在凍干機(jī)擱板上進(jìn)行。不銹鋼電極直徑為2.5mm，長(zhǎng)度為20mm。兩電極間的距離為15mm，插入物料的深度l0mm，電極間需要夾緊裝置，以避免電極與物料接觸不良。測(cè)溫?zé)犭娕嫉臏y(cè)量端位于兩電極的中間部位。電極和熱電偶裝配后，將物料置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)的擱板上，降低擱板溫度，凍結(jié)物料，測(cè)量物料的電阻與溫度間的變化關(guān)系，用相應(yīng)軟件如Origin處理測(cè)得的數(shù)據(jù)，求出其一階導(dǎo)數(shù)曲線，可找出電阻突變點(diǎn)，從而確定物料共晶點(diǎn)溫度。升高擱板溫度，測(cè)量物料升溫過(guò)程電阻和溫度的變化關(guān)系，用相應(yīng)軟件如Origin處理測(cè)得的數(shù)據(jù)，求出其一階導(dǎo)數(shù)曲線，找出電阻突變點(diǎn)，確定物料的熔融點(diǎn)溫度。

用上述自制測(cè)量裝置測(cè)得降溫過(guò)程中螺旋藻電阻R隨溫度T的變化如圖4-2所示，為使電阻突變的點(diǎn)顯得更明顯，對(duì)圖4-2求一階導(dǎo)數(shù)，得圖4-3，由圖4-3可知，在-18℃左右電阻的變化最快，由此可知螺旋藻的共晶點(diǎn)溫度在-18℃左右。

升溫過(guò)程中螺旋藻的電阻R隨溫度T的變化如圖4-4所示，圖44一階導(dǎo)數(shù)曲線如圖4-5。由圖4-5可知，在-19~-7℃左右電阻的變化最快，由此可知螺旋藻的熔融點(diǎn)溫度在-19℃左右。

降溫過(guò)程納豆激酶溶液的電阻R與溫度T之間的關(guān)系如圖4-6所示，圖4-6的一階導(dǎo)數(shù)曲線如圖4-7所示，分析圖4-6和圖4-7可知納豆激酶溶液的共晶點(diǎn)溫度在-23℃左右。

升溫過(guò)程中納豆激酶的電阻R隨溫度T的變化如圖4-8所示，圖4一8一階導(dǎo)數(shù)曲線如圖4-9所示，由圖4-9可知，在-23~-15℃左右電阻的變化較大，由此可知納豆激酶溶液的熔融點(diǎn)溫度在-23℃左右。

降溫過(guò)程鮮海參肉的電阻R與溫度T之間的關(guān)系如圖4-10所示，圖4-10的一階導(dǎo)數(shù)曲線如圖4-11所示，由圖4-11可知鮮海參肉在-30℃以后電阻增加非?？?，分析圖4-11，在-35℃以后，電阻值增量非常大，由此可知，鮮海參肉的共晶點(diǎn)在-35℃左右。

4.1.2一種典型液態(tài)物料共晶點(diǎn)測(cè)試儀

由四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司生產(chǎn)的液態(tài)物料的共晶點(diǎn)測(cè)試儀如圖4-12所示，圖4-13是共晶點(diǎn)測(cè)試儀測(cè)量探頭工作示意圖。

如圖4-12和圖4-13所示，該共晶點(diǎn)測(cè)試儀主要由以下幾個(gè)部分構(gòu)成。

1、開(kāi)關(guān)  開(kāi)關(guān)打到“開(kāi)”位置，即開(kāi)始正常工作，隨著物料的冷凍或升溫測(cè)試儀自動(dòng)測(cè)量判斷共晶點(diǎn)或熔融點(diǎn)；打到“關(guān)”位置，系統(tǒng)斷電，設(shè)備停止運(yùn)行。

2、LCD顯示屏  LCD顯示屏實(shí)時(shí)顯示物料的當(dāng)前溫度以及共晶點(diǎn)和熔融點(diǎn)，其第一行顯示的Tnow為溫度探頭測(cè)量得到的當(dāng)前溫度，第二行顯示的為測(cè)量得到的共晶點(diǎn)和熔融點(diǎn)，其中Tj為共晶點(diǎn)，Tr為熔融點(diǎn)。

3、測(cè)量探頭及支座  共晶點(diǎn)測(cè)試儀的溫度探頭采用加長(zhǎng)的P1000溫度探頭，阻抗探頭采用特殊定制的不銹鋼探針。為了實(shí)現(xiàn)探頭的固定以及確保其相對(duì)位置，探頭支座采用聚四氟乙烯材料加工裝配而成，探頭測(cè)量高度可通過(guò)高度調(diào)節(jié)旋鈕進(jìn)行調(diào)節(jié)，以適應(yīng)不同高度的西林瓶和物料液面。

4、探頭接口  用于測(cè)量探頭與測(cè)試儀主體連接，開(kāi)始測(cè)量前，須確保探頭插頭與測(cè)試儀主體可靠對(duì)接。

其使用操作步驟為：

1、將待測(cè)試的物料裝入西林瓶中，調(diào)節(jié)支架高度，使共晶點(diǎn)測(cè)試儀的探頭能浸入物料液面下，再鎖緊調(diào)節(jié)螺釘。

2、將測(cè)試儀探頭、支架以及裝有物料的西林瓶放入凍干機(jī)內(nèi)，關(guān)閉凍干機(jī)門(mén)。

3、將共晶點(diǎn)測(cè)試儀的電源插頭插入220V交流電源插座中。

4、打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，共晶點(diǎn)測(cè)試儀即自動(dòng)進(jìn)入共晶點(diǎn)、共熔點(diǎn)測(cè)定程序。此時(shí)開(kāi)啟凍干機(jī)進(jìn)行相應(yīng)冷凍與加熱操作即可。

此共晶點(diǎn)測(cè)試儀的主要特點(diǎn)是，智能化自動(dòng)判斷物料共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)，采用兩行式液晶顯示屏，直接顯示物料的共晶點(diǎn)和熔融點(diǎn)，能實(shí)時(shí)顯示當(dāng)前物料溫度，儀器性能穩(wěn)定、可靠，操作簡(jiǎn)單。

4.2凍干過(guò)程的分析與觀察

4.2.1 低溫顯微鏡

Hsu等將重組CD4-IgG(CD4-免疫球蛋白G)用四級(jí)串聯(lián)的帕耳帖組件冷卻至-60℃，用一架低溫顯微鏡觀察到了它的再結(jié)晶過(guò)程。他的觀察室也可以被抽成真空而用于冷凍干燥研究。

Willemer將多次由低溫顯微鏡獲得的照片與電阻測(cè)量的結(jié)果進(jìn)行了比較，低溫顯微鏡的結(jié)構(gòu)如圖4-14所示。復(fù)雜產(chǎn)品的電阻測(cè)量有時(shí)很難解釋清楚。圖4-15所示的是某種病毒的低溫保護(hù)溶液的電阻-溫度曲線。冷卻到-10℃，部分溶液凍結(jié)，然后過(guò)冷到約-46℃，在-65℃左右時(shí)溶液結(jié)晶。在溶液復(fù)溫過(guò)程中，在-32.5℃左右時(shí)，電阻值變化迅速。用低溫顯微鏡獲得的照片顯示出，在-40℃時(shí)，已被干燥和冷凍的兩部分都呈現(xiàn)出均勻的組織結(jié)構(gòu)（如圖4-16）。而在-30℃時(shí)，這兩部分都呈現(xiàn)出了黑色和灰色混合的區(qū)域，這表明，一些冰已經(jīng)融化，并且擴(kuò)散到了已干燥的部分。在這種情況下，通過(guò)改變CPA的濃度以及選擇一個(gè)最佳的冷卻速度，電阻測(cè)量可以認(rèn)為是一種比較迅速的研究不同CPA的影響的方法。最終選擇的濃度和冷卻速度的組合可以用低溫顯微鏡來(lái)測(cè)試。圖4-17所示的是在冷凍、熱處理過(guò)程中以及在干燥前，一種藥品在低溫顯微鏡下的結(jié)構(gòu)變化。圖4-17~圖4-19所示的是來(lái)自同一實(shí)驗(yàn)中，同一樣品的不同部分以及在不同的實(shí)驗(yàn)階段的細(xì)節(jié)照片。

圖4-17中，(a)是快速冷卻過(guò)程中，約在-24℃時(shí)樣品的照片，(b)是第一次從-54℃加熱到約-36℃的照片，(c)是再次被冷卻到-54℃時(shí)的照片。在圖(a)中，大部分晶體（顏色較深處）均勻地分布在濃縮的非晶固體（顏色較亮處）中間。在圖(b)中，晶體有所生長(zhǎng)，濃縮物中的水分也已經(jīng)結(jié)晶。在圖（c）中，晶體與玻璃狀雜質(zhì)的邊界清晰可見(jiàn)，特別是在圖中右上角更明顯。圖4-18所示的是在一些具有可比性的溫度下，樣品另外的一個(gè)部分，即靠近樣品邊界的顯微照片：(a)約在-23℃，(b)第一次加熱時(shí)，約在-30℃，(c)再次冷卻到-60℃。圖(b)中，晶體已有所生長(zhǎng)，但其大致結(jié)構(gòu)沒(méi)有太大的變化，特別是在圖的左上角部分。在圖(c)中，晶體與玻璃狀物質(zhì)的邊界更加清晰。圖4-18所示的是樣品的第三部分：(a)冷卻到一65℃之后的照片，(b)熱處理后，再次冷卻到-60℃，然后在-40℃開(kāi)始凍干。同樣，熱處理并未使整體結(jié)構(gòu)有所改變，但是晶體結(jié)構(gòu)更加清晰，這表明玻璃相和晶體之間的水分子已經(jīng)遷移到晶體中。圖4-17~圖4-19中的照片說(shuō)明，快速冷卻不能使整個(gè)樣品的各個(gè)部分形成均勻的組織結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼤?huì)受到邊界效應(yīng)的影響。但是，在樣品的所有部分都觀察到了熱處理的影響。圖4-20所示的是，從冷卻結(jié)束溫度（-60℃)上升到開(kāi)始干燥溫度（-42℃）時(shí)，不經(jīng)熱處理對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響。值得注意的是，在自動(dòng)向低溫?cái)R板上裝載產(chǎn)品時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。第一次裝載藥瓶中的產(chǎn)品與后來(lái)裝載的，例如2~3h后裝載的，產(chǎn)品有不同的結(jié)構(gòu)。

低溫顯微鏡研究的優(yōu)點(diǎn)是有可以顯示樣品組織結(jié)構(gòu)變化過(guò)程的照片，而且，凍結(jié)的產(chǎn)品可以在大多數(shù)的設(shè)備中被冷凍干燥。產(chǎn)品層很薄，因此可以被迅速冷凍。所以，產(chǎn)品在復(fù)溫和干燥過(guò)程中所表現(xiàn)出的性狀特征與快速冷凍過(guò)程的相一致。因?yàn)楫a(chǎn)品層很薄，故模擬熱處理的過(guò)程很困難。然而，實(shí)驗(yàn)表明，從此項(xiàng)研究中獲得的臨界溫度是有價(jià)值的，特別是獲得冷凍速率相對(duì)緩慢時(shí)產(chǎn)品的電阻值。

Nunnerf使用一臺(tái)特殊的低溫顯微鏡拍攝到了0.9%的NaCl溶液在360s內(nèi)直接冷凍到穩(wěn)定樹(shù)枝狀冰晶結(jié)構(gòu)的過(guò)程中冰晶邊界面變化的照片（如圖421）。在冰晶的表面可見(jiàn)因濃縮而集中起來(lái)的NaCI(黑色邊界)。

Cosman等人描述了一臺(tái)可以定量評(píng)價(jià)照片的低溫顯微鏡，該裝置有如下四個(gè)顯著特點(diǎn)：

①溫度的產(chǎn)生、測(cè)量和控制是由程序控制的;

②顯微照片可以存檔，以備后用；

③文檔可部分地用于自動(dòng)圖像識(shí)別;

④如果冷凍過(guò)程可以用數(shù)學(xué)的方法描述，而且細(xì)胞的行為可以預(yù)測(cè)，則用上述方法可以減少數(shù)據(jù)量。

圖4-22表示的低溫顯微鏡系統(tǒng)的布置圖。通過(guò)使用熱傳導(dǎo)性非常優(yōu)良的藍(lán)寶石觀察窗和使用液氮冷卻系統(tǒng)，作者實(shí)現(xiàn)了以每分鐘幾百度的冷卻速率冷卻到一60℃，而且在溫度為0℃時(shí)，樣品內(nèi)的溫度梯度達(dá)到了0.1℃/mm。

下面用三個(gè)例子來(lái)說(shuō)明使用這種顯微鏡系統(tǒng)如何進(jìn)行冷凍過(guò)程的定量研究和存檔。圖4-23表示的是被分離的老鼠胰島細(xì)胞的體積與溫度的函數(shù)關(guān)系曲線。如圖4-24所示，細(xì)胞膜對(duì)水和CPA的滲透性的不同對(duì)細(xì)胞的冷凍是非常重要的。

將獼猴卵母細(xì)胞置入體積分?jǐn)?shù)10%的二甲基亞砜溶液(DMSO)后其體積幾乎減少到原來(lái)的三分之一，這是因?yàn)樗軓募?xì)胞里擴(kuò)散到周?chē)h(huán)境中去，而二甲基亞砜卻不能擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)（測(cè)量溫度為23℃）。

細(xì)胞損壞的原因在于細(xì)胞內(nèi)冰晶成核。圖4-25表示在不同冷卻速率下，有多少老鼠卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰與溫度之間的函數(shù)關(guān)系曲線。老鼠肝細(xì)胞在以大約40℃/min的速率冷卻到-21℃的過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰，然而，當(dāng)以140℃/min速率冷卻時(shí)幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都存在冰，這是因?yàn)樗疀](méi)有足夠的時(shí)間擴(kuò)散到周?chē)h(huán)境就被凍結(jié)在細(xì)胞內(nèi)。圖4-25也說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)冰晶成核是由絕對(duì)溫度和冷卻速率決定的：在大約-25℃，以5℃/min速率冷卻幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都有冰，然而，以3.5℃/min速率冷卻，大約20%的細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有冰。

Dawson和Hockley利用掃描電子顯微鏡(SEM)表明了海藻糖和甘露醇溶液的快速冷凍(150℃/min)和慢速冷凍(1℃/min)時(shí)結(jié)構(gòu)上的差異。圖4-26表示1%海藻糖溶液被(a)慢速和(b)快速冷凍時(shí)中心部位的表面結(jié)構(gòu)。慢速冷凍樣品（c）濃縮的固體表面上產(chǎn)生裂縫，然而，快速冷凍的樣品的結(jié)構(gòu)卻是均勻的纖維狀。圖4-27表示慢速和快速冷凍1%乳糖時(shí)其中心部位粗糙的(a)和精細(xì)的(b)結(jié)構(gòu)。在圖4-28(a)中可發(fā)現(xiàn)海藻糖溶流崩塌的部分，圖（b)表示干燥后產(chǎn)品在潮濕的環(huán)境下貯存6個(gè)月以后的結(jié)構(gòu)，圖片表明不同的冷凍速率導(dǎo)致不同的結(jié)構(gòu)，且有可能使固體濃縮在表面上，在干操過(guò)程使干燥速率降低，殘余水分含量增加。

4.2.4 熱力學(xué)分析

Carrington等人利用熱力學(xué)分析(TMA)研究了30%質(zhì)量分?jǐn)?shù)果糖、蔗糖和葡萄糖在有和沒(méi)有羧甲基纖維素鈉(CMC)存在時(shí)冰的結(jié)晶溫度。TMA被用來(lái)測(cè)量冷凍和復(fù)溫過(guò)程樣品的膨脹，利用DSC也做了類似的研究。用TMA測(cè)得果糖在有和沒(méi)有CMC存在，以5℃/min的速率冷凍時(shí)的具有代表性的結(jié)果如圖4-39所示。圖4-40表示的是由TMA確定的30%蔗糖溶液慢速冷凍和熱處理后的加熱曲線。圖4-41表示的是由DSC確定的30%蔗糖溶液慢速冷凍和熱處理后的加熱曲線。比較由兩種方法測(cè)得的關(guān)于蔗糖的兩個(gè)溫度Tr1和Tr2(如圖4-40和圖4-41所示)，Tr1≈-60℃(TMA)和-41.2℃(DSC),Tr2≈-35℃(TMA)和-32.6℃(DSC),很明顯，正如作者所討論的那樣，有很多因素影響最后所得的數(shù)據(jù)。

TMA測(cè)量對(duì)解釋在加熱冷凍的甘露醇和其他立體異構(gòu)體溶液過(guò)程中，小玻璃瓶的破裂是很有用的。例如，甘露醇在-25℃以上體積比標(biāo)準(zhǔn)1型無(wú)色玻璃擴(kuò)大30倍。小玻璃瓶是否破壞主要取決于填充物的體積及濃度，例如，當(dāng)裝滿3%的甘露醇時(shí)，10%-40%的玻璃瓶子被破壞。

4.2.5 介電分析

Pearson Smith通過(guò)三個(gè)例子解釋了介電分析（DEA）的優(yōu)點(diǎn)是可提供最優(yōu)的凍干工藝。結(jié)合水（兩個(gè)氫鍵）和吸附水（一個(gè)氫健）的弛豫特性不同可用來(lái)確定凍干的結(jié)束，當(dāng)吸附水解吸和結(jié)合水仍然存在時(shí)認(rèn)為凍干結(jié)束。物質(zhì)的介質(zhì)響應(yīng)與晶體的尺寸和水合程度有關(guān)。賦形劑的玻璃體形成特性和它的分子的流動(dòng)性（黏性）與溫度和水合密切相關(guān)。電介質(zhì)的研究表明了糖溶液玻璃體形成的非阿倫尼烏斯(non-Arrhennius)行為，在溫度或水合有微小變化時(shí)，黏性的變化將達(dá)好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

Morris等人建議利用介電分析法可預(yù)測(cè)雙組分物質(zhì)的崩塌溫度。DEA的基本情況已解釋清楚了?！鞍l(fā)射顏率”(TOF)是確定崩塌溫度的分析方法。圖4-42表示介質(zhì)損耗因子與頻率之間的函數(shù)關(guān)系曲線。作者稱此曲線最低點(diǎn)的頻率為T(mén)OF。如圖4-43所示TOF隨著溫度的變化而變化。兩直線的交叉點(diǎn)可確定崩塌溫度。用TOF預(yù)測(cè)的10%的蔗糖、10%海藻糖、10%山梨糖醇以及11%的

Azactam TM溶液的崩塌溫度稍低于凍干顯微鏡觀察得的崩塌溫度，偏差分別為-3℃，-1.4℃，2.2℃和0.7℃。

Smith等人認(rèn)為介電弛緩頻譜學(xué)提供了一種研究聚合物和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性的方法，其中，還提供了含水量和水的狀態(tài)信息。

4.2.6 X射線衍射學(xué)-拉曼光譜學(xué)            

Cavatur和Suryanarayanant研制了一種低溫X射線粉末衍射(XRD)技術(shù)，用于研究?jī)鼋Y(jié)水溶液中溶質(zhì)的固體狀態(tài)。在凍結(jié)的乙氧萘青霉素鈉溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%）中，未發(fā)現(xiàn)共晶結(jié)晶。在-4℃熱處理可引起溶液的結(jié)晶，且隨熱處理時(shí)間而增加，另外兩種產(chǎn)品的研究表明，XRD在不干涉其他事件的情況下，可提供結(jié)晶程度的信息。

Sane等人利用拉曼光譜學(xué)用數(shù)量表示了冷凍干燥和噴射干燥過(guò)程結(jié)構(gòu)的變化。單克隆抗體類（例如RhuMAbVEGF)在沒(méi)有低溫保護(hù)劑的情況下，經(jīng)歷二次結(jié)構(gòu)變化。增加低溫保護(hù)劑的摩爾比率可完全保護(hù)其結(jié)構(gòu)。利用拉曼光譜學(xué)觀察到干燥蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性是與結(jié)構(gòu)變化相關(guān)的。

4.3 凍干過(guò)程中物料含水量的測(cè)量

(1)稱重法   這是一種古老的方法，也是直接測(cè)量法。在凍干箱內(nèi)設(shè)置稱重機(jī)構(gòu)，小凍干機(jī)內(nèi)可以設(shè)置天平，大型凍干機(jī)內(nèi)可以設(shè)置地秤或吊秤，實(shí)現(xiàn)邊抽真空邊觀察重量的變化。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易學(xué)；缺點(diǎn)是不夠準(zhǔn)確。

(2)取樣法   在抽真空干燥過(guò)程中，通過(guò)設(shè)置在凍干機(jī)上的裝置，取出樣品，在大氣環(huán)境下測(cè)量產(chǎn)品的含水量這種方法比較麻煩，但是比較準(zhǔn)確。取出的樣品可以用直接稱重法，也可以用水分測(cè)量?jī)x測(cè)量。圖4-44是一種常用的水分測(cè)量?jī)x，稱為鹵素快速水分測(cè)定儀，它是一種新型快速的水分檢測(cè)儀器，其原理為利用熱重分析法。圖4-44為OHAUS MB45型鹵素水分測(cè)定儀，其測(cè)量精度可達(dá)0.001g/0.01%。

(3)在線測(cè)量法凍干過(guò)程水分在線測(cè)量是一種最準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的測(cè)量方法，只可惜目前還沒(méi)有上市的產(chǎn)品。

4.4 凍干終點(diǎn)的判斷

凍干過(guò)程結(jié)束的判斷很重要，它涉及凍干產(chǎn)品的質(zhì)量、產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。但是，到目前為止，還沒(méi)有科學(xué)的儀器和方法，現(xiàn)有的判斷方法還是經(jīng)驗(yàn)法，不夠準(zhǔn)確。

（1）溫度判斷法   在凍干過(guò)程中通常都需要測(cè)量擱板溫度和物料溫度，并且繪出溫度曲線。當(dāng)測(cè)出的擱板溫度與物料溫度相接近時(shí)，即可以認(rèn)為干燥過(guò)程接近結(jié)束。

（2）壓力判斷法   在凍干過(guò)程中應(yīng)該不斷的測(cè)量?jī)龈上鋬?nèi)的壓力（真空度），當(dāng)測(cè)得的壓力長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定不變（根據(jù)凍干產(chǎn)品的品種、數(shù)量不同，通常在1~2個(gè)小時(shí)即可），認(rèn)為凍干過(guò)程可以結(jié)束。

（3）濕度判斷法   這是一種理論上可行，但實(shí)際操作比較困難的方法。這種方法需要在凍干箱內(nèi)裝上濕度計(jì)，測(cè)出凍干箱內(nèi)氣氛的濕度，進(jìn)而判斷干燥工藝是否可以結(jié)束。

4.5 凍干產(chǎn)品的質(zhì)量分析

      4.5.1 殘余水分的測(cè)量                       

產(chǎn)品殘余水分的測(cè)量應(yīng)除去從周?chē)h(huán)境中吸收的水分。將干燥產(chǎn)品裝入其他容器時(shí)，或稱量的時(shí)候都應(yīng)該在充滿干燥氣體的箱子或隔離器中進(jìn)行。

箱子應(yīng)該能容納P2O5，或可用干燥氣體清洗。在隔離器中進(jìn)行的時(shí)候應(yīng)帶上固定在隔離器上的手套。干燥氣體中用來(lái)稱量的天平需要做一些調(diào)整以避免靜電荷，這有可能導(dǎo)致相當(dāng)大的錯(cuò)誤。

      4.5.1.1 重量分析法                          

正如美國(guó)食品和藥品操作規(guī)范第21項(xiàng)610.13條中所說(shuō)的，在前幾年，這種方法成為強(qiáng)制性的規(guī)范。被稱的樣品存儲(chǔ)在溫度在十20～十30℃之間的干燥室中，連同P2O5被反復(fù)稱量直到質(zhì)量不變?yōu)橹?。樣品的最小量?yīng)該大于100mg，若有必要可取自多個(gè)小瓶。較高的溫度可使達(dá)到質(zhì)量不變的時(shí)間縮短，但是會(huì)引起更多的結(jié)合水解吸甚至使產(chǎn)品變質(zhì)。利用這種方法，在+20～+30℃時(shí)，發(fā)現(xiàn)水很少被凝固到固體上。

      4.5.1.2 Karl Fischer(KF)法             

利用這種方法被稱量的干產(chǎn)品被溶解在甲醇中，用Karl Fischer溶液滴定直到顏色由棕色變?yōu)辄S色。視覺(jué)觀察可由電流計(jì)代替，當(dāng)?shù)味ńY(jié)束時(shí)，電流突然增加，這種方法樣品的重量可比重量分析法減小2一4倍。為了完全地避免視覺(jué)觀察產(chǎn)生的誤差，利用電解可產(chǎn)生碘，用庫(kù)侖定律計(jì)算水的含量，這種儀器（見(jiàn)圖4-45）

在商業(yè)上是可得到的。用這種方法可測(cè)得的水的最小量為l0μg。Wckx和DeKlejin說(shuō)明了如何使Karl Fisher法被直接使用于小瓶裝的已干產(chǎn)品。Karl Fischer法不能直接用于在Karl Fischer試劑中能和碘起反應(yīng)或不能溶于甲醇或水分無(wú)法被甲醇吸取的產(chǎn)品。Karl Fischer儀器如圖4-46所示。

4.5.1.3 熱重分析法

熱重分析法(TG，TG/MS)是在程序控溫下，測(cè)量物質(zhì)的質(zhì)量隨溫度（或時(shí)間）的變化關(guān)系，用來(lái)研究材料的熱穩(wěn)定性和組分。檢測(cè)質(zhì)量最常用的辦法就是天平。熱重分析儀如圖4-47所示。May等人描述了在稱量過(guò)程中，如何區(qū)分質(zhì)譜儀的讀數(shù)是解吸出來(lái)的水的還是揮發(fā)性物質(zhì)的，揮發(fā)性物質(zhì)有可能來(lái)自殘余溶劑或部分產(chǎn)品的分解。

當(dāng)前鹵素快速水分測(cè)定儀是一種新型快速的水分檢測(cè)儀器，其原理就是利用熱重分析法。

May等人用TG，TG/MS，KF法和一種命名為“蒸氣壓濕度測(cè)量法”(VPM)的新型測(cè)量方法研究了α-干擾素和美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)百日咳疫苗的殘余水分(RM)。VPM測(cè)量密閉小瓶中物料上面的空間中水的蒸氣壓。來(lái)自紅外二極管的光線穿過(guò)小瓶到達(dá)圖像探測(cè)器。小瓶的溫度從室溫以固定的速率冷卻到一55℃。當(dāng)水蒸氣冷凝的時(shí)候，由于凝結(jié)物使光束變暗，從而改變圖像探測(cè)器的信號(hào)。凝結(jié)溫度可轉(zhuǎn)化為壓力，從而可計(jì)算出頂部空間中水的微觀圖。圖4-48表示α-干擾素的TG值。抽取的三種不同樣品中，發(fā)現(xiàn)RM的平均值為1.15%土0.15%。利用KF法發(fā)現(xiàn)一種樣品中的RM為1.28%。圖4-49表示百日咳疫苗樣品9的相應(yīng)數(shù)據(jù)。水的最終解吸溫度和開(kāi)始分解的溫度由重量隨時(shí)間變化的函數(shù)的導(dǎo)數(shù)曲線確定(%/mi)；當(dāng)導(dǎo)數(shù)曲線偏離水平線時(shí)可認(rèn)為水的解吸結(jié)束。在表4-1總結(jié)了不同方法我得的結(jié)果，VMP不能提供關(guān)于產(chǎn)品RM的值息。該方法可重復(fù)測(cè)量同樣的小瓶在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)品上空的水分，從而確定水分的變化量。

4.5.1.4 紅外光譜學(xué)

Lin和Hsu描述了用近紅外線(NIR)光譜學(xué)確定密封的玻璃瓶中蛋白質(zhì)類藥品的殘余水分的方法。研究了五種蛋白質(zhì)：人類單克隆抗體重組細(xì)胞(ruhMAb)E25、ru- hMAb HER2、rubMAb CDI1a、TNKase和rt-PA，在小瓶壁的水平位置上加入適量的MilliQ水可使殘余水分的量增加，使水蒸氣擴(kuò)散到已干產(chǎn)品。一般情況下，1～2天后可達(dá)到平衡狀態(tài)。利用常用的三種數(shù)學(xué)工具來(lái)確定復(fù)雜光譜（不同成分的重合部分或它們之間的化學(xué)反應(yīng))。研究了下列因素對(duì)IR標(biāo)準(zhǔn)的影響結(jié)果：賦形劑的濃縮，塊狀產(chǎn)品的疏松度，厚度和直徑以及賦形劑和蛋白質(zhì)的比率，Karl Fischer滴定數(shù)（也叫RF)被用來(lái)作為與NIR數(shù)相比較的標(biāo)準(zhǔn)。

圖4-50中(a)～(e)表示5種產(chǎn)品RF和RNIF之間的關(guān)系。Karl Fischer滴定法依每日的操作者的不同其波動(dòng)范圍為士0.5%。因此，RF和RNIR之間的差別≤0.5%認(rèn)為是較好的。在30～100mg/mL之間疏松度的變化≤0.5%。塊狀物的尺寸必須超過(guò)NIR的透深，否則測(cè)得的RNIR太小。

制劑成分允許有小的變化，然而變化較大時(shí)，例如，蔗糖由42.5mmo/L變?yōu)?70mmol//L，隨著濃度的增加吸收率增加（圖4-51）。因此對(duì)85mmol/L的RNIR的標(biāo)準(zhǔn)不能用于蔗糖的濃度較低(42.5mmo/L)或較高(>120mm0l/L)的情況；在520cm-1時(shí)水的信號(hào)隨著產(chǎn)品信號(hào)的改變而變化。通常情況下，對(duì)于給定的制劑和產(chǎn)品尺寸RNIR標(biāo)準(zhǔn)是一定的，只有在NIR測(cè)量對(duì)于充足的被反射光線具有足夠長(zhǎng)的光程以及校準(zhǔn)產(chǎn)品的光譜隨組分濃度的改變沒(méi)有被改變的情況下，變化才是允許的。

4.5.1.5 殘余水分測(cè)量方法的比較

干燥產(chǎn)品中的水以多種形式結(jié)合：如存在于表面的水，或多或少與干物質(zhì)結(jié)合的水或以結(jié)晶水的形式存在著的水。因此，對(duì)于不同的物質(zhì)，各種方法有可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。利用重量分析法和Karl Fischer滴定法測(cè)得的有些物質(zhì)的RM值幾乎是沒(méi)什么不同的。May等人提供了四種這類物質(zhì)的例子，但是如表4-2所示，利用重量分析法得到的RM值比Karl Fischer滴定法得到的小0.3%～0.6%，然而，用熱重分析方法得到的RM值在誤差范圍內(nèi)與Karl Fischer滴定法得到的值是非常接近的。在圖4-52中比較了在第二階段干燥過(guò)程，利用KF測(cè)得的RM和利用DR值計(jì)算得到的dW值。用于KF測(cè)量的小瓶當(dāng)時(shí)是封閉的，上面的圖表示出了平均值以及誤差條。同樣的藥品在同一臺(tái)設(shè)備上，在相同的工藝條件和相同的裝載量的情況下進(jìn)行了三次試驗(yàn)過(guò)程。利用KF測(cè)得的RM值在MD轉(zhuǎn)變?yōu)镾D后以士1%改變，約21h后減少為土0.5%。三次試驗(yàn)過(guò)程dW值都在SD階段開(kāi)始后以士0.5%改變，在21h后小于0.05%。上下曲線表明，到達(dá)最終溫度后，進(jìn)一步的干燥不可能再降低RM的值0.5%。根據(jù)dW也可得到相同的信息：在21h后水的解吸可忽略，由于其小于0.02%/h。此產(chǎn)品在所選的工藝條件下，用KF法測(cè)得1.5%的水分在此溫度下及可接受的時(shí)間內(nèi)不能用解吸法除去。