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  heitiansh1 2017-09-02 00:00:00

  TRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，Z大特點(diǎn)是可同時(shí)分離一個(gè)樣品的RNA\DNA\蛋白質(zhì)．TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNaseYZ劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。 TRIzol試劑可用于小量樣品（50-100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）。對(duì)人，動(dòng)物，植物組織，細(xì)菌均適用，可同時(shí)處理大量不同樣品，整個(gè)提取過程在一小時(shí)內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護(hù)分析和分子克隆。在用于RT-PCR時(shí)如果兩條引物存在于一個(gè)單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn)，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于Western Blotting。 預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)： 1． 經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來源。 2． 使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交*污染。 3． RNA在TRIzol試劑中時(shí)不會(huì)被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。 4． 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v，放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。） RNA的提取 準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制) 操作步驟: 1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。 b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。 c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。 2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。 6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。 7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。 8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。 10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。 注意事項(xiàng)： 1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響diyi鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。 2．勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。 3．分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī)，2600×g離心30-60分鐘。 預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為： 肝和脾6-10μg ，腎3-4μg ，骨骼肌和腦組織1-1.5μg ，胎盤1-4μg ，上皮細(xì)胞8-15μg ，成纖維細(xì)胞5-7μg 。 常見問題分析： 得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不徹底 B．RNA沉淀未完全溶解 A260/A280<1.65 ：A.檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高 B．樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少 C．勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘 D．吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相 E．RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解：A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍 B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃ C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過度 D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理 E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5 DNA污染: A. 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少 B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇，DMSO等)，強(qiáng)緩沖液或堿性溶液 蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進(jìn)可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心，按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，GX沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時(shí)應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。 DNA的分離 準(zhǔn)備試劑：乙醇 0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH 操作步驟: 1. 樣品加氯仿分層后，移去上層水相，用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2-8℃不超過2000×g離心5分鐘。 2. 移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進(jìn)一步操作見后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2-8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次。 3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇，室溫放置10-20分鐘(不時(shí)顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鐘， 棄上清。 4. 室溫放置晾干DNA 5-15分鐘，用8mM NaOH溶解DNA。從50-70mg組織或107細(xì)胞中分離的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鐘除去。 DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水測(cè)A260值。一單位A260值相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計(jì)細(xì)胞數(shù)，人，大鼠，小鼠1×106二倍體細(xì)胞含DNA的量分別為7.1μg ， 6.5μg ， 5.8μg 。 預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取DNA分別為肝和腎3-4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2-3μg 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細(xì)胞（1×106）5-7μg 成纖維細(xì)胞5-7μg 應(yīng)用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4，取0.1-1μg DNA用作模板。 2.酶切反應(yīng) 用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值。每μg DNA使用3-5單位的酶，80-90%的DNA是可消化的。 1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié) Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl) 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159 注意事項(xiàng)： 1. DNA在中間層和有機(jī)相中時(shí)可在2-8℃保存過夜。 2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存幾個(gè)月。 3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長(zhǎng)期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃長(zhǎng)期保存。

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