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  齊愛無比 2010-08-01 00:00:00

  有預測軟件可以預測，實驗的話也不能得到非常準確的等電點 你上Expasy，上面有預測工具，輸入你的蛋白序列即可

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  蟑螂小飛飛 2010-07-22 00:00:00

  科技名詞定義 中文名稱：等電點 英文名稱：isoelectric point 定義：蛋白質(zhì)或兩性電解質(zhì)(如氨基酸)所帶凈電荷為零時溶液的pH，此時蛋白質(zhì)或兩性電解質(zhì)在電場中的遷移率為零。符號為pI。 所屬學科： 生物化學與分子生物學(一級學科) ；氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)(二級學科) 等電點聚焦測蛋白質(zhì)等電點 一、實驗原理 等電點聚集實質(zhì)就是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方 法。在電場中充有兩性載體和抗對流介質(zhì)，當加上電場后，由于兩性電解載體移動的結(jié)果，在兩極之間逐步建立起穩(wěn)定的PH梯度，當?shù)鞍踪|(zhì)分子或其它兩性分子存在于這樣的PH梯度中時，這種分子便會由于其表面電荷在此電場中運動，并Z終到達一個使其表面靜電荷為零的區(qū)帶，這時的PH則是這種蛋白質(zhì)的PI。IEF技術(shù)的關鍵是得到一定范圍的穩(wěn)定的PH梯度。也即找到合適的兩性載體。 二．實驗試劑 1．丙烯酰胺單體儲液 丙烯酰胺[Aa]30%[W/V]，甲叉雙丙烯酰胺[Bis]0.8%[W/V] 2．核黃素 0.025%[W/V] 3．Ampholien PH3.5-9 凝膠工作液 Aa：Bis 1ml 甘油 0.25ml Ampholine PH 3.5-9 0.4ml 雙蒸水 3.25ml 搖勻，用水泵抽氣10分鐘，加入0.025%核黃素0.15ml，搖勻后用滴管灌入玻管中。 4．25%[W/V]蔗糖水溶液，用于配制蛋白樣品 5．10%蔗糖水溶液，用來鋪于樣品層上部。 6．電極液： 上槽 0.02M H3PO4 1000ml 下槽 0.01M NaOH 600ml 7．染色液： 0.01%考馬斯亮藍R-250 5%三 5%磺基水楊酸 三．實驗儀器與器具 玻璃管4×120mm 4支 封口膜 試管架 細長滴管 注射器及長針頭 玻片、刀片 10ml玻璃瓶 微量可調(diào)移液器 圓盤電泳槽及電泳儀 四．操作步驟 1．圓柱體凝膠制備，用封口膜將玻管（4×120mm）的一端封口，將玻管套上橡皮塞，加入凝膠混合液至10cm處，輕輕鋪上一層雙蒸水，置于日光燈下待其聚合。 2．聚焦電泳 （1）將電泳下槽注入0.01M NaOH、將套有橡膠塞的玻璃管插入電泳槽（注意塞緊所有的孔，以防電極液下露）。將上槽連同電泳管置于下槽上，此時凝膠下端與電極液接觸，注意排除凝膠下表面的氣泡。 （2）加樣100μl蛋白含量2-5μg。 （3）在樣品上輕輕一層10%的蔗糖，直至頂端，作為隔離層。 （4）上槽注入0.02M H3PO4，注意不要攪混樣品層和隔離層。 （5）接上電源，正極接酸，負極接堿。恒定在120V，通電16-18小時至電流降至0為止。 3．蛋白質(zhì)染色及等電點測定： （1）取膠 將凝膠后的含樣品的凝膠借助長注射器針頭注水取出。 （2）蛋白樣品的染色由于兩性載體Ampholine可與多種蛋白染色劑結(jié)合，并形成不溶性復合物，因此一般需要染色前除去Ampholine。本實驗直接將凝膠置于三中浸泡，立刻可見蛋白帶。 （3）PH梯度測定 取液，分別加入于10只小玻璃瓶中，將欲測的PH梯度的膠條置于玻璃片上，用刀片切成長的小段，按順序放入有編號的小玻璃瓶中，蓋好橡皮塞，將凝膠段在室溫下浸泡過夜，次日用PH計測每支小瓶中浸泡液PH值。將得到的PH值對凝膠長度作圖，得標準曲線。 （4）樣品的PH值測定。測定出染色蛋白帶的位置，在PH梯度曲線上求出相對應PH值既是此樣品的PI。 五．實驗結(jié)果 測定十個小管中膠條的PH分別為7.14、7.86、7.50、6.96、6.38、5.74、5.10、4.49、4.13。以膠條距堿端的距離為橫坐標，PH值為縱坐標作圖： 經(jīng)過測量，待測蛋白距堿端為7.3cm，浸泡后膠的總長度為10.5cm，等比例換算得距離應為6.95，帶入公式得待測蛋白的PI值為：4.64 查表得知與牛血清白蛋白的等電點接近。 六、討論 1、載體兩性電解質(zhì)含量2％~3%比較適合，能形成好的梯度。 2、制膠用丙稀酰胺Z好是重結(jié)晶的。過硫酸銨要新配的。所有的水都要用重蒸水。 3、樣品必須無鹽，否則電泳時樣品條帶可能走歪，拖尾或者根本不成條帶。加樣的量要適當，避免過多電泳后條帶不清晰。 4、由于堿性漂移作用，膠條堿端Z初1cm的pH值過低，故作圖時舍去。 （5）本實驗結(jié)果中同時加入待測和以前提取兩種蛋白（未發(fā)現(xiàn)條帶，可能樣品含鹽量過大），待測蛋白在三中固定后即可看到明顯的白色條帶，故未用染色液染色即可測量遷移距離。

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