在往期分享中，我們介紹了IVIS成像系統(tǒng)在動(dòng)物水平的眾多應(yīng)用，其實(shí)IVIS同樣可以用于全植物成像。此次我們就分享IVIS在水稻氮代謝研究中的應(yīng)用。

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的養(yǎng)分，但其在土壤中的濃度往往達(dá)不到Z佳作物生長(zhǎng)濃度。因此，提高作物氮素利用率被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個(gè)主要目標(biāo)。然而，關(guān)于作物氮代謝仍有許多需要了解的地方。

在此，研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)分子傳感器系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)水稻中氮的狀態(tài)，該方法發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》雜志上。研究中首先利用該系統(tǒng)研究了尿囊素的作用，尿囊素分解為尿囊素衍生的代謝物，在低濃度下作為氮源使用。參與尿素代謝的兩個(gè)基因尿囊素酶(OsALN)和尿素滲透酶1 (OsUPS1)，對(duì)氮狀態(tài)高度敏感，在低氮條件下，OsALN迅速上調(diào)，而高氮條件下OsUPS1表達(dá)上調(diào)?；谏鲜鰴C(jī)制，研究人員培育了含有氮分子傳感器系統(tǒng)的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]轉(zhuǎn)基因水稻。這種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以模擬內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即OsALN和OsUPS1基因?qū)ν庠碞狀態(tài)的響應(yīng)。

文中使用兩種方法來(lái)測(cè)定分子氮傳感器的能力：

方法一：在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株在高濃度氮源培養(yǎng)基(GM+N)或不含氮源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM-N)中培養(yǎng)5天，隨后使用IVIS活體成像系統(tǒng)進(jìn)行成像及定量。

結(jié)果顯示，生長(zhǎng)在GM+N培養(yǎng)基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表現(xiàn)出更高的熒光素酶活性（圖1A）。為了對(duì)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行定量，研究人員測(cè)定了5個(gè)獨(dú)立的純合系（具有單個(gè)基因拷貝）。生長(zhǎng)在GM+N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株發(fā)光信號(hào)強(qiáng)于GM-N組20倍，而強(qiáng)于對(duì)照組約2,800倍（圖1B）。

方法二：在短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株先在GM-N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，第5天在加入100nM硫酸銨。結(jié)果顯示，同長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，生長(zhǎng)在后期加 氮培養(yǎng)基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，發(fā)光信號(hào)更強(qiáng)（圖1C）。同樣對(duì)5株獨(dú)立的純合系進(jìn)行了定量，生長(zhǎng)在后期加N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)于GM-N培養(yǎng)基中約50倍，而強(qiáng)于對(duì)照組13,000倍（下圖1D）。

圖1.在高氮培養(yǎng)條件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)。

(A)對(duì)照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培養(yǎng)基 中培養(yǎng)5天；

(B)5個(gè)獨(dú)立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)條件下，發(fā)光定量結(jié)果；

(C)對(duì)照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生長(zhǎng)5天, 或者在GM–N培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4天，然后加入100 mM硝酸銨培養(yǎng)1天；

(D)5個(gè)獨(dú)立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)條件下的定量結(jié)果，以對(duì)照組作為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化 。

這些結(jié)果說(shuō)明，proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器能夠通過(guò)發(fā)光信號(hào)水平檢測(cè)外源氮的情況。

同樣在研究中對(duì)proALN::ALN-LUC2 植株進(jìn)行了相同的處理。結(jié)果顯示，在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，GM+N和GM-N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的proALN::ALN-LUC2 沒(méi)有明顯差異（圖2A）。對(duì)5株獨(dú)立的純品系進(jìn)行發(fā)光信號(hào)定量，相比GM+N培養(yǎng)基，GM-N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的proALN::ALN-LUC2 植株發(fā)光信號(hào)要高約1.8倍，比對(duì)照組高約17倍（圖2B）。因此很難鑒定GM+N和GM-N培養(yǎng)基對(duì)生長(zhǎng)的影響。而在短時(shí)間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)生長(zhǎng)在GM-N培養(yǎng)基中的proALN::ALN-LUC2，發(fā)光信號(hào)要強(qiáng)于加高氮培養(yǎng)1天的。

圖2.在低氮培養(yǎng)條件下，proALN::ALN-LUC2 植株顯示強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)。

(A)對(duì)照組和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng).；

(B)A組相對(duì)定量結(jié)果；

(C)對(duì)照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培養(yǎng)5天，或者在GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，然后加入100 mM 硝酸銨再培養(yǎng)1天 ；

(D)C組相對(duì)定量結(jié)果；GM–N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的對(duì)照組植株作為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

此外，在文章中，還利用IVIS活體成像系統(tǒng)，探討了該傳感器對(duì)于氮源是否具有選擇性及對(duì)于氮源的敏感性。結(jié)果顯示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 對(duì)于氮源無(wú)特異性，可以廣泛的作為水稻等植株中分子氮的傳感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀濃度> 1mM即表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)，而低氮濃度(< 0.01mM)信號(hào)減弱。0.1mM硝酸鉀proUPS1:: UPS1-LUC2 植株誘導(dǎo)強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)，而0.1mM硝酸銨和硫酸銨則沒(méi)有。這表明， proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器監(jiān)測(cè)高氮狀態(tài)，低氮狀態(tài)。proALN::ALNLUC2 在低氮濃度(<0.1 mM)下表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光素酶活性，而在高氮濃度下表現(xiàn)出較弱的活性(> 10mM)。

綜上，分子氮傳感器的信號(hào)反映了分子氮的內(nèi)部狀態(tài)。結(jié)合IVIS活體成像技術(shù)，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作為分子傳感器在不同研究中監(jiān)測(cè)大米內(nèi)部氮狀態(tài)。

文獻(xiàn)來(lái)源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.

腫瘤在體內(nèi)只有一個(gè)目標(biāo)，就是不停地生長(zhǎng)！生長(zhǎng)！生長(zhǎng)！在生長(zhǎng)的過(guò)程中不可避免的要消耗掉大量的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以腫瘤會(huì)構(gòu)建自身的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)用于養(yǎng)分和氧氣的輸送，這些腫瘤內(nèi)部搭建的血管就是腫瘤的能量供應(yīng)站。因此切斷腫瘤的主動(dòng)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，破壞腫瘤的能量代謝系統(tǒng)，就能YZ腫瘤細(xì)胞的增殖，從而“餓死”癌細(xì)胞。

但是，這種能量切斷不是廣義上的讓病人減少進(jìn)食，或者少吃營(yíng)養(yǎng)的東西，這樣會(huì)使正常組織得不到足夠的能量導(dǎo)致免疫力下降。真正的饑餓療法具有選擇性，可以特異性的YZ腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程（圖1），實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的jing準(zhǔn)致命打擊。

圖1 特異性YZ腫瘤細(xì)胞能量代謝

級(jí)聯(lián)納米酶靶向腫瘤“饑餓”環(huán)境

通過(guò)級(jí)聯(lián)納米催化藥物的設(shè)計(jì)，將葡萄糖氧化酶(GOx)和過(guò)氧化氫酶(CAT)通過(guò)pH響應(yīng)的聚合物交聯(lián)形成級(jí)聯(lián)納米酶，通過(guò)血清蛋白將納米酶和抗腫瘤前藥復(fù)合形成納米藥物。腫瘤的酸性環(huán)境可以將納米酶釋放，COx迅速消耗腫瘤細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和氧氣，產(chǎn)生饑餓和缺氧環(huán)境，切斷腫瘤能量供應(yīng)的同時(shí)提升前藥系統(tǒng)的化學(xué)治LX果，并且消耗葡萄糖產(chǎn)生的毒副產(chǎn)物H₂O₂也可以快速被CAT分解，以避免產(chǎn)生全身毒性。這種結(jié)合靶向饑餓環(huán)境并結(jié)合缺氧化學(xué)ZL的方案可以有效YZ腫瘤細(xì)胞的增殖，不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，通過(guò)小動(dòng)物光學(xué)成像可以清楚的看到級(jí)聯(lián)納米酶顆粒在腫瘤部位的富集隨時(shí)間的變化情況，以及48小時(shí)后納米酶顆粒在各個(gè)臟器中的分布情況。

圖2 基于級(jí)聯(lián)納米酶的納米藥物設(shè)計(jì)以及在體內(nèi)的靶向分布情況

參考文獻(xiàn)

Ma Y, Zhao Y, Bejjanki N K, et al. Nanoclustered Cascaded Enzymes for Targeted Tumor Starvation and Deoxygenation-Activated Chemotherapy without Systemic Toxicity[J]. ACS nano, 2019, 13(8): 8890-8902.

光照誘導(dǎo)腫瘤能量代謝阻斷

通過(guò)新型納米顆粒的構(gòu)建，利用腫瘤細(xì)胞高表達(dá)組織蛋白酶B的特性，設(shè)計(jì)酶剪切開(kāi)關(guān)，將載有光敏劑的介孔納米硅和和定位序列修飾的氧化鎢顆粒偶聯(lián)在一起形成行星-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)。被腫瘤細(xì)胞攝取后納米顆?？梢员桓弑磉_(dá)的組織蛋白酶B剪切，行星-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)分開(kāi)，配合不同波段的光照同時(shí)引發(fā)光動(dòng)力和光熱效應(yīng)，切斷腫瘤氧化磷酸化和糖酵解過(guò)程，阻斷能量供應(yīng)，YZ腫瘤的增殖。通過(guò)小動(dòng)物活體光學(xué)成像進(jìn)行肝部轉(zhuǎn)移腫瘤的體內(nèi)表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種納米顆粒配合光照可以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生“饑餓”環(huán)境，通過(guò)YZ腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)清除體內(nèi)的轉(zhuǎn)移腫瘤。而正常細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶B含量不足，行星-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)無(wú)法分開(kāi)，在光照過(guò)程中光動(dòng)力產(chǎn)生的單線態(tài)氧可以進(jìn)一步氧化納米氧化鎢顆粒，阻礙光熱反應(yīng)的發(fā)生，不會(huì)影響到正常組織的代謝過(guò)程，證實(shí)了可以基于能量代謝的腫瘤選擇性jing準(zhǔn)ZL策略的可行性。

圖3 光照切斷腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)

參考文獻(xiàn)

Huo D, Zhu J, Chen G, et al. Eradication of unresectable liver metastasis through induction of tumour specific energy depletion[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-17.

      眾所周知，多功能納米載體可以有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞并且在體外具有良好的抗腫瘤效果。但是目光轉(zhuǎn)向體內(nèi)，這些納米載體往往在免疫系統(tǒng)的攻擊下集體失靈。因?yàn)?，人體免疫系統(tǒng)將會(huì)感知納米載體的入侵，并且非常努力的把我們精心設(shè)計(jì)的載體清除掉。一旦納米載體被清除掉，藥物就很難到達(dá)目標(biāo)腫瘤區(qū)域，很難實(shí)現(xiàn)殺傷腫瘤的效果。因此，納米醫(yī)學(xué)的一個(gè)非常重要的課題就是在不破壞免疫系統(tǒng)的前提下，讓納米載體躲避免疫系統(tǒng)的攻擊。

      傳統(tǒng)的解決方案我們都是通過(guò)在納米載體表面攜帶各種偽裝工具，盡量和免疫細(xì)胞捉迷藏，能躲則躲，絕不露面。但是這些載體也很容易迷路， 到達(dá)深層腫瘤部位的很少，并且在和免疫系統(tǒng)的斗智斗勇中，還會(huì)激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生新的抗體從而加速納米載體的清除，因此很難達(dá)到ZL的效果。而隨著仿生納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們可以讓納米載體穿上“吉利服”，不但可以在免疫系統(tǒng)中潛伏下來(lái)，還可以大搖大擺的從免疫細(xì)胞的眼皮底下蒙混過(guò)關(guān)，發(fā)揮極大功效。這種“吉利服”就是細(xì)胞膜提取物，不同種類細(xì)胞提取的細(xì)胞膜包覆在納米載體表面還可以表現(xiàn)出特殊的功效，像紅細(xì)胞膜或者一些免疫細(xì)胞膜可以提高納米載體的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，腫瘤細(xì)胞膜可以特異識(shí)別同源腫瘤等。穿上“細(xì)胞膜吉利服”之后，納米載體將顯現(xiàn)各方面的優(yōu)勢(shì)和潛力，從而成為近年來(lái)多功能納米載體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

1、T細(xì)胞膜包裹下仿生納米藥物的免疫識(shí)別增強(qiáng)

      通過(guò)糖代謝技術(shù)，獲取嵌入疊氮基團(tuán)（N3）的功能化T細(xì)胞，并提取功能化T細(xì)胞膜包裹在吲哚菁綠/聚合物納米載體表面，構(gòu)建仿生納米光敏劑。功能化T細(xì)胞膜上不但原本的抗原受體可以賦予納米光敏劑識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力，并且N3基團(tuán)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞糖代謝靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)納米載體在腫瘤內(nèi)部的富集，通過(guò)小動(dòng)物光學(xué)成像可以清楚的看到T細(xì)胞膜包裹下仿生納米藥物在腫瘤部位的靶向作用，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤的jing準(zhǔn)可視化ZL。

功能化T細(xì)胞膜仿生納米顆粒實(shí)現(xiàn)特異性的腫瘤靶向和jing準(zhǔn)光熱ZL

參考文獻(xiàn)：T Cell Membrane Mimicking Nanoparticles with Bioorthogonal Targeting and Immune Recognition for Enhanced Photothermal Therapy.  Advanced Science. 2019: 1900251.

2、生物學(xué)重編程全抗原細(xì)胞膜助力納米疫苗的研發(fā)

      將腫瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞融合細(xì)胞的生物學(xué)重編程細(xì)胞膜包覆在金屬有機(jī)化合物表面，構(gòu)建腫瘤疫苗可以在融合細(xì)胞膜表面表達(dá)大量免疫刺激分子，從而使得包裹融合細(xì)胞膜的納米載體像抗原呈遞細(xì)胞一樣直接作用T細(xì)胞從而激活免疫反應(yīng)。通過(guò)小動(dòng)物光學(xué)成像，可以看到重編程細(xì)胞膜包覆的納米載體在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)到達(dá)腫瘤部位的過(guò)程。到達(dá)腫瘤部位的納米載體還可以被樹(shù)突細(xì)胞識(shí)別，從而誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟，增強(qiáng)免疫效果，Z終消除腫瘤，從而拓展腫瘤ZL平臺(tái)。

生物學(xué)重編程細(xì)胞膜包裹納米載體的過(guò)程以及腫瘤免疫的激活

參考文獻(xiàn)： Cytomembrane nanovaccines show therapeutic effects by mimicking tumor cells and antigen presenting cells. Nature Communications. 2019, 10(1): 3199.

3、腫瘤細(xì)胞膜包裹的黑磷納米載體拓寬光熱腫瘤免疫ZL

      手術(shù)切除的腫瘤組織含有對(duì)患者特異性的新抗原，是成為制備個(gè)體化腫瘤疫苗Z好的材料來(lái)源。作者利用細(xì)胞膜封裝的方式在二維光熱黑磷量子點(diǎn)（BPQDs）表面包裹腫瘤組織的細(xì)胞膜，從而制備具有光熱效應(yīng)的納米腫瘤疫苗(BPQD-CCNVs)，并且把納米腫瘤疫苗和集落刺激因子（GM-CSF）裝入熱敏水凝膠中。皮下注射水凝膠后可以在紅外光的作用下持續(xù)釋放納米疫苗以及集落刺激因子，招募并激活DC細(xì)胞，從而捕獲腫瘤抗原并激活腫瘤特異性T細(xì)胞。同時(shí)，尾靜脈注射PD-1YZ劑，阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)通路，增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)。通過(guò)活體光學(xué)成像我們可以對(duì)腫瘤進(jìn)行生物發(fā)光標(biāo)記，從而長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤在體內(nèi)的發(fā)展情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)光熱免疫ZL可以有效清除實(shí)體腫瘤同時(shí)YZ術(shù)后轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)。

(A)光熱腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路；

(B)FITC標(biāo)記的水凝膠在體內(nèi)的降解情況；

(C)個(gè)性化光熱腫瘤免疫ZL可以有效YZ術(shù)后實(shí)體腫瘤的復(fù)發(fā)；

(D)個(gè)性化光熱腫瘤免疫ZL可以有效YZ術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：Surgical Tumor-Derived Personalized Photothermal Vaccine Formulation for Cancer Immunotherapy. ACS nano. 2019, 13(3): 2956-2968.

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隨著生活水平和YL衛(wèi)生狀況的不斷提升，寄生蟲(chóng)感染在我們?nèi)粘Ｉ钪兴坪跻讶諠u陌生。但在一些欠發(fā)達(dá)地區(qū)，由于貧困和不良的衛(wèi)生習(xí)慣造成的寄生蟲(chóng)感染仍然威脅著無(wú)數(shù)生命。隱孢子蟲(chóng)作為一種常見(jiàn)的人畜共患寄生蟲(chóng)感染性疾病，是導(dǎo)致腹瀉病的主要原因。由于其經(jīng)由糞便傳播，所以常經(jīng)由水體污染而在衛(wèi)生條件較差的地區(qū)發(fā)生群體性感染。感染通常是自限性的，健康的成年人在發(fā)生第 一階段的較嚴(yán)重的腹瀉之后便可恢復(fù)，但糞便仍可能具有傳染性。新生兒或免疫力低下的如艾滋病患者或經(jīng)免疫YZZL的病人在感染后病情較嚴(yán)重，是兒童早期死亡、營(yíng)養(yǎng)不良和生長(zhǎng)遲緩的重要原因，也是艾滋病人并發(fā)腹瀉死亡的主要原因。

現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲(chóng)共有15個(gè)亞種，分別感染人、家禽、寵物、牲畜以及一些野生動(dòng)物。由于不了解其致病機(jī)制，目前的ZL方案往往是對(duì)癥用藥而非對(duì)因用藥。由于不同物種間感染模式差異，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(主要為牛等家畜)上應(yīng)對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染的有效疫苗往往對(duì)預(yù)防人的感染收效甚微。

針對(duì)以上問(wèn)題，來(lái)自美國(guó)賓大獸醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種可用在小鼠模型中模擬與人患隱孢子蟲(chóng)病相似病癥的隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium tyzzeri), 同時(shí)利用IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)幫助他們?cè)隗w研究隱孢子蟲(chóng)的感染以及宿主經(jīng)寄生蟲(chóng)或疫苗免疫激活后的抗感染現(xiàn)象。該研究于近期發(fā)表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。

要在小鼠體內(nèi)模擬人患隱孢子蟲(chóng)病的合理模型，首先就需要找到相應(yīng)的隱孢子蟲(chóng)。作者在農(nóng)場(chǎng)收集了大量小家鼠糞便，經(jīng)由測(cè)序，鑒定出一株與感染人的兩種隱孢子蟲(chóng)(C. parvum和C. hominis)Z接近的一種鼠隱孢子蟲(chóng)(C. tyzzeri)。同時(shí)為了后續(xù)在體觀察其感染模式以及宿主抗感染效果，作者通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)將Luciferase基因和mCherry熒光蛋白導(dǎo)入到隱孢子蟲(chóng)的基因組中，構(gòu)建了一株可以進(jìn)行活體以及顯微觀察的隱孢子蟲(chóng)。

圖一C. tyzzeri的鑒定以及基因編輯 (上：隱孢子蟲(chóng)種間基因組相似性比較，AB為常見(jiàn)感染人的兩種隱孢子蟲(chóng)，C為常見(jiàn)感染鼠的隱孢子蟲(chóng))

構(gòu)建好的隱孢子蟲(chóng)就可以進(jìn)行活體觀察了，由于有活力的隱孢子蟲(chóng)可以表達(dá)Luciferase，在底物熒光素的作用下便可自發(fā)熒光，通過(guò)IVIS活體成像系統(tǒng)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)隱孢子蟲(chóng)的繁殖情況。作者將這一光學(xué)觀察方式與傳統(tǒng)的糞便qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，二者具有很好的一致性。作者除了觀察到這一新鑒定的隱孢子蟲(chóng)感染和人患隱孢子蟲(chóng)病的感染部位以及病理表征一致之外，還觀察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隱孢子蟲(chóng)的危害，這一點(diǎn)與臨床上免疫缺陷病人的高發(fā)病致死率也剛好吻合。

圖二  C. tyzzeri感染模式觀察

有了這一能夠很好模擬人隱孢子蟲(chóng)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之后，便可以利用這一模型進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)的ZL以及疫苗的開(kāi)發(fā)。由于臨床上隱孢子蟲(chóng)高發(fā)地區(qū)人們?cè)诟腥救笤俣雀腥镜母怕蚀蟠蠼档停虼俗髡呤紫葯z驗(yàn)了蟲(chóng)體是否可以直接作為疫苗來(lái)進(jìn)行感染的預(yù)防。利用未經(jīng)Luciferase標(biāo)記的C. tyzzeri進(jìn)行第 一次感染，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組使用滅活的蟲(chóng)體作為疫苗進(jìn)行第 一次免疫，在感染后用廣譜抗蟲(chóng)藥巴龍霉素殺滅后用Luc標(biāo)記C. tyzzeri進(jìn)行二次感染，能夠觀察到接觸活蟲(chóng)的小鼠幾乎不會(huì)發(fā)生二次感染，而使用滅活蟲(chóng)體作為疫苗無(wú)法激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的抗感染作用。

圖三 使用滅活的C. tyzzeri無(wú)法預(yù)防感染

因此作者想到可以使用減毒的活蟲(chóng)對(duì)宿主進(jìn)行第 一次免疫。通過(guò)射線進(jìn)行寄生蟲(chóng)減毒處理，可以降低其感染力至無(wú)害水平。在減毒活蟲(chóng)感染后30天，在使用Luc標(biāo)記的C. tyzzeri進(jìn)行感染，能夠觀察到該方法與野生型活蟲(chóng)二次感染模型有著相同的抗感染作用，說(shuō)明減毒的疫苗是一種行之有效的預(yù)防隱孢子蟲(chóng)感染的方式。但是由于要調(diào)動(dòng)自身免疫系統(tǒng)，這一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。

圖四 使用減毒疫苗可以有效對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行預(yù)防

雖然這篇文章也并未真正解決隱孢子蟲(chóng)的抗感染問(wèn)題，但是構(gòu)建出針對(duì)這一寄生蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)小鼠模型已經(jīng)為后續(xù)的科研工作者嘗試更多ZL方案和預(yù)防措施提供了可操作可監(jiān)控的實(shí)驗(yàn)工具。

參考文獻(xiàn)

1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00

關(guān)于珀金埃爾默：

珀金埃爾默致力于為創(chuàng)建更健康的世界而持續(xù)創(chuàng)新。我們?yōu)樵\斷、生命科學(xué)、食品及應(yīng)用市場(chǎng)推出獨(dú)特的解決方案，助力科學(xué)家、研究人員和臨床醫(yī)生解決Z棘手的科學(xué)和YL難題。憑借深厚的市場(chǎng)了解和技術(shù)專長(zhǎng)，我們助力客戶更早地獲得更準(zhǔn)確的洞見(jiàn)。在，我們擁有12500名專業(yè)技術(shù)人員，服務(wù)于150多個(gè)國(guó)家，時(shí)刻專注于幫助客戶打造更健康的家庭，改善人類生活質(zhì)量。2018年，珀金埃爾默年?duì)I收達(dá)到約28億美元，為標(biāo)準(zhǔn)普爾500指數(shù)中的一員，紐交所上市代號(hào)1-877-PKI-NYSE。

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蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為植物科學(xué)研究中重要的工具，以O(shè)rbitrap為代表的高分辨質(zhì)譜技術(shù)已在植物蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域產(chǎn)生重要的科研成果，發(fā)表在Nature Plant，Plant Cell 等核心期刊上。

利用Orbitrap質(zhì)譜可針對(duì)植物樣本描繪細(xì)胞和亞細(xì)胞蛋白定位，以及追蹤蛋白之間的相互作用，鑒定不同細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的蛋白組分。同時(shí)可以利用TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行定量植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析，此外，基于Orbitrap的多組學(xué)研究策略可以結(jié)合蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)，整合基因組信息針對(duì)植物從多分子層面的大數(shù)據(jù)重新定義樣本的分型、挖掘蛋白水平上與相關(guān)基因突變、表達(dá)關(guān)系及關(guān)鍵分子調(diào)控機(jī)制。

讓我們以幾篇經(jīng)典文章為例，一探orbitrap助力的植物蛋白質(zhì)組學(xué)前沿發(fā)現(xiàn)：

1

植物蛋白質(zhì)定性定量研究以及

相關(guān)蛋白藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

Roman Lagoutte利用炔基標(biāo)記的去氧地膽草素類似物與SILAC蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定去氧地膽草素在多種癌細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)蛋白。作者首先合成了一系列具有kang癌作用的去氧地膽草素的類似物并對(duì)這些化合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析篩選，且證明了去氧地膽草素的細(xì)胞毒性是由細(xì)胞凋亡而非細(xì)胞壞死引起；接著利用帶有炔基標(biāo)簽的去氧地膽草素類似物，在多種細(xì)胞系中通過(guò)SILAC標(biāo)記定量和無(wú)標(biāo)定量（Label-Free）的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)去氧地膽草素的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，在MCF7細(xì)胞中鑒定出11個(gè)新的去氧地膽草素的靶蛋白。該研究成果發(fā)表在Nature Communication雜志上。

2

植物相關(guān)蛋白質(zhì)水平翻譯化修飾研究

上海逆境生物學(xué)研究ZX研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，揭示了植物雷帕霉素靶蛋白（TOR）激酶和脫落酸（ABA）受體偶聯(lián)的信號(hào)途徑間通過(guò)相互磷酸化修飾，介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的平衡。該策略是利用磷酸化組學(xué)分析研究植物逆境機(jī)理的案例。

該研究成果發(fā)表在Molecular Cell雜志上，如下圖所示：

3

TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)

深入研究植物生長(zhǎng)發(fā)育衰老過(guò)程

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員為了研究花瓣衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)變化過(guò)程泛素化修飾的變化。用乙烯處理可以廣泛地改變植物中的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組譜。泛素化是真核生物中的主要翻譯化，在蛋白質(zhì)降解中起重要作用。

在本研究中，作者首先通過(guò)RNA測(cè)序獲得參考矮牽牛（Petunia hybrida）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。構(gòu)建的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，然后對(duì)乙烯處理后的矮牽?；ü趗biquitylome進(jìn)行定量。在乙烯處理后16小時(shí)，共有3,606個(gè)蛋白質(zhì)和2,270個(gè)遍在蛋白化位點(diǎn)進(jìn)行定量。乙烯處理后，發(fā)現(xiàn)284個(gè)下調(diào)蛋白和233個(gè)上調(diào)蛋白，320個(gè)上調(diào)和127個(gè)下調(diào)泛素化位點(diǎn)（P <0.05），表明在矮牽牛的乙烯介導(dǎo)的花冠衰老過(guò)程中全泛素化水平有所提升。泛素連接酶在蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。此外呢，全蛋白質(zhì)組和Ubiquitylome是負(fù)相關(guān)的，乙烯介導(dǎo)的花冠衰老過(guò)程中泛素化促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。

該研究成果發(fā)表在Plant Physiol雜志上，如下圖所示：

4

基于Orbitrap多組學(xué)研究

多層面解析植物蛋白

和代謝物以及基因表達(dá)關(guān)系

Fionn McLoughlin利用orbitrap超高分辨質(zhì)譜分析蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，以及代謝組數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，進(jìn)行多組學(xué)分析。在多組學(xué)上分析玉米自噬與缺氮脅迫的聯(lián)系，研究者選用了自噬受損突變體，基因敲低與野生型作為實(shí)驗(yàn)材料，在富氮、缺氮條件下進(jìn)行培養(yǎng)。選擇了玉米幼苗的第二片葉和第四片葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組探討自噬對(duì)于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響。蛋白與轉(zhuǎn)錄層面，缺氮條件下，缺氮脅迫的通路轉(zhuǎn)錄上調(diào)，葉綠體組分的表達(dá)受到Y(jié)Z。在第二片葉和第四片葉中分別鑒定到了3,327和3,801個(gè)蛋白。分析結(jié)果顯示，自噬作用相對(duì)于缺氮脅迫，對(duì)于蛋白組的調(diào)控變化影響更大。該研究成果發(fā)表在Nature Plant雜志上。

腫瘤異質(zhì)性及轉(zhuǎn)移性

人類大多數(shù)腫瘤是異質(zhì)性的，由具有不同性質(zhì)的細(xì)胞克隆組成，呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。高度異質(zhì)性腫瘤具有較差的臨床LX，但其潛在機(jī)制仍不清楚。腫瘤的轉(zhuǎn)移性是大多數(shù)癌癥患者死亡的原因。因此，了解轉(zhuǎn)移進(jìn)程的驅(qū)動(dòng)因子是改善臨床結(jié)果的關(guān)鍵。

癌癥基因組測(cè)序研究已經(jīng)確定了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間具有極小的遺傳差異，并顯示原位腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶具有顯著的亞克隆異質(zhì)性。Z近的一些研究表明：微觀環(huán)境變化是腫瘤轉(zhuǎn)移傳播和生長(zhǎng)的主要媒介，從而突出了在腫瘤進(jìn)展中的非細(xì)胞自發(fā)因子的作用。

本期IVIS視角小編帶您探究一下NatureZ近發(fā)表的論文：《亞克隆合作通過(guò)修飾局部和全身的免疫微觀環(huán)境驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移》

本文揭示了表達(dá)IL11和FIGF (VEGFD)的乳腺癌細(xì)胞的小亞克隆協(xié)同作用促進(jìn)轉(zhuǎn)移進(jìn)展并產(chǎn)生了驅(qū)動(dòng)性和中性亞克隆組成的多克隆轉(zhuǎn)移。單克隆、多克隆原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)譜分析顯示了這種協(xié)同作用是間接的，是通過(guò)局部和系統(tǒng)微環(huán)境介導(dǎo)的。作者確定中性粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞群受表達(dá)IL11小亞克隆的調(diào)節(jié)，敲除中性粒細(xì)胞的表達(dá)，可以阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)。來(lái)自原發(fā)性腫瘤、血液和肺的CD45陽(yáng)性細(xì)胞群的單細(xì)胞RNA-seq顯示IL11作用于骨 髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，可誘導(dǎo)產(chǎn)生致瘤性和轉(zhuǎn)移性中性粒細(xì)胞前體。本文結(jié)合IVIS活體成像系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)了非細(xì)胞自發(fā)因子和小亞克隆在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。

探究驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移的亞克隆協(xié)同作用分子機(jī)制

本文用人類乳腺癌細(xì)胞系(MDAMB-468)的腫瘤（來(lái)源于異質(zhì)性腫瘤異種移植模型），研究亞克隆在腫瘤表型之間的相互作用。作者之前已經(jīng)證實(shí)一個(gè)小的亞克隆通過(guò)非細(xì)胞自主的相互作用可以驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)。本文測(cè)試了18個(gè)亞克隆，每一種表達(dá)一種與轉(zhuǎn)移和血管再生有關(guān)的分泌蛋白。并發(fā)現(xiàn)具有全部18個(gè)亞克隆的多克隆腫瘤生長(zhǎng)Z快（上圖a）。相反只有白細(xì)胞介素11 (IL11) 和趨化因子 (C-C motif) 配體5在單克隆腫瘤能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。我們還確定了表達(dá)IL11和低聚果糖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子（FIGF也被稱為VEGFD）的亞克隆兩者的混合物在很大程度上能夠復(fù)制腫瘤這種生長(zhǎng)特點(diǎn)。

克隆之間合作導(dǎo)致多克隆轉(zhuǎn)移

Nature Cell Biology :Published: 01 July 2019

https://www.nature.com/articles/s41556-019-0346-x

IL11缺失的多克隆腫瘤阻止了腫瘤的生長(zhǎng)，揭示了IL11和FIGF因子在腫瘤生長(zhǎng)中的協(xié)同作用。此外，多克隆腫瘤和僅包括IL11和FIGF亞克隆的腫瘤具有高度的轉(zhuǎn)移性（上圖b）。

本文首先驗(yàn)證含有IL11+和FIGF+驅(qū)動(dòng)因子的原發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤MDA-MB-468的克隆能力，像中性子亞克隆。單克隆或綠色熒光蛋白 (GFP)的多克隆混合物熒光素酶表達(dá)親本細(xì)胞，紅色熒光蛋白 (RFP)植入v5標(biāo)記的IL11+細(xì)胞、RFP+FIGF+細(xì)胞植入到免疫缺陷NOG小鼠的乳腺脂肪墊。我們每周用卡尺測(cè)量原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)情況并通過(guò)每周生物發(fā)光觀察轉(zhuǎn)移病灶成像。多克隆腫瘤（含5% IL11+、5%的FIGF+RFP+細(xì)胞和90%的GFP+親本細(xì)胞）生長(zhǎng)較快，轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)與單克隆和親本腫瘤相比（如下圖a）。

中性粒細(xì)胞的系統(tǒng)性表達(dá)降低YZ了由IL11+和FIGF+亞克隆驅(qū)動(dòng)的多克隆腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散(或生長(zhǎng))，因此，中性粒細(xì)胞的表型和功能特點(diǎn)取決于宿主環(huán)境。

CD45+細(xì)胞群的單細(xì)胞分析

鑒于作者之前的結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。作者比較了DOX+或DOX-誘導(dǎo)小鼠血液和肺中性粒細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特點(diǎn)。IL11和FIGF誘導(dǎo)上調(diào)了幾個(gè)信號(hào)通路如：TGFβ和JAK-STAT信號(hào)通路，它們與中性粒細(xì)胞的免疫系統(tǒng)中腫瘤預(yù)生成和預(yù)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這些特征來(lái)自肺部，而不是來(lái)自血液。盡管中性粒細(xì)胞在肺部有變化，作者通過(guò)single-cell RNA-seq沒(méi)有檢測(cè)到IL11或GIGF受體的表達(dá)。然而，IL11RA的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本在單獨(dú)的細(xì)胞組中明顯存在，這些細(xì)胞不能歸為中性粒細(xì)胞或其他白細(xì)胞亞群。

這些IL11RA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)編碼GP130和SATA3的IL6ST基因，GP130是IL11信號(hào)通路中所必需的共同受體。STAT3是LI11下游的作用因子?；诩?xì)胞群中基因表達(dá)情況，其中還包括細(xì)胞外基質(zhì)和發(fā)育相關(guān)蛋白，作者將該群體標(biāo)記為和IL11反應(yīng)的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MStrCs)。雖然這個(gè)群體沒(méi)有表達(dá)典型的間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)標(biāo)記物，但其表現(xiàn)了普遍存在于干細(xì)胞相關(guān)基因的顯著特征，這表明它可能是一種未特征化的間充質(zhì)干細(xì)胞前體。之前的研究已經(jīng)描述過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞與白細(xì)胞之間的相互作用由多種細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)的。

在本文的研究中，作者著重于研究?jī)蓚€(gè)分泌因子，選擇的基礎(chǔ)是基于作者之前的數(shù)據(jù)，它是由較小的亞克隆表達(dá)的且協(xié)同作用促進(jìn)轉(zhuǎn)移。IL11屬于IL6家族的細(xì)胞因子，并在多種癌癥的耐藥性進(jìn)展中起著重要的作用，包括前列腺癌和結(jié)腸癌。在乳腺癌中，IL11被認(rèn)為和ZL的耐藥性和骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，以及作為不良預(yù)后的標(biāo)志物。FIGF是VEGFR2和VEGFR3的配體，可以刺激血管生成和淋巴管生成。

本文發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞可能不是IL11直接作用的細(xì)胞靶點(diǎn)，但可通過(guò)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞分泌因子（MStrCs）間接影響IL11。有趣的是，這些基質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)PLXDC2和ANTXR1，這在腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞中是高表達(dá)的。因此，這些IL11RA陽(yáng)性的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可能是產(chǎn)生多種細(xì)胞類型的祖細(xì)胞。對(duì)中性粒細(xì)胞亞型的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的中性粒細(xì)胞靶向工具結(jié)合抗腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)的藥物，有可能被用于預(yù)防乳腺癌轉(zhuǎn)移研究。

PerkinElmer IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在該研究中提供了支持，如需了解詳情歡迎與我們的工程師取得聯(lián)系。

復(fù)制右方鏈接了解IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)：https://url.cn/5fSl2r4

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日立電鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域的多維度應(yīng)用

【時(shí)間: 2020/4/15  下午15:00】

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1引言

      隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人們法律意識(shí)的不斷提高，涉及經(jīng)濟(jì)合同的案件越來(lái)越多，其中包括油墨的鑒定、筆跡的添加和涂改、公章印文的真?zhèn)?、噴墨和激光打印字跡的鑒定、筆畫(huà)先后順序及朱墨時(shí)序的鑒定等。由于刑偵鑒定檢材有限，且有重要的證據(jù)價(jià)值，以往采用的鑒定技術(shù)和方法，有的對(duì)文件物證造成一定損壞，尋找一種快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的檢驗(yàn)方法顯得尤為重要。而拉曼光譜技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)檢材的零破壞，并且能夠快速、有效檢出字跡的異同點(diǎn)，從而鑒定不同的筆跡，在司法文書(shū)鑒定中取得了令人滿意的結(jié)果，鑒定結(jié)果可以為法庭訴訟提供科學(xué)依據(jù)。

2 拉曼光譜鑒定原理

      拉曼光譜技術(shù)是一種分子散射光譜技術(shù)，具有快速、靈敏和無(wú)損檢驗(yàn)的特點(diǎn)，近些年來(lái)在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。拉曼光譜技術(shù)主要是借助物質(zhì)分子的振動(dòng)譜峰來(lái)識(shí)別物質(zhì)的不同成分，因?yàn)椴煌奈镔|(zhì)其分子結(jié)構(gòu)不同，因此其振動(dòng)譜峰也會(huì)有所不同，而振動(dòng)譜峰的位置可以非常靈敏地反映出不同物質(zhì)的成分變化。應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)還可以對(duì)被檢客體的物質(zhì)成分進(jìn)行定量分析，即通過(guò)測(cè)定振動(dòng)譜峰所涵蓋的曲線積分面積大小來(lái)分析被檢客體中所含物質(zhì)組分的含量多少。因此，應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)成分的識(shí)別及定量的分析。檢驗(yàn)字跡正是利用了這一點(diǎn)，對(duì)筆畫(huà)進(jìn)行拉曼光譜掃描，確定二者是否存在成分差異，若存在差異，則證明筆跡是偽造的。

      日常書(shū)寫(xiě)所使用的黑色簽字筆的書(shū)寫(xiě)色料成分有三種類型，diyi類色料是全部由炭黑組成；第二類色料是不含炭黑成分，全部由多種顏色的染料拼制而成；第三類色料是含有部分炭黑成分和其他染料組成?；诖?，書(shū)寫(xiě)人在進(jìn)行偽造字跡時(shí)使用了色料成分不同類型的筆，那么偽造部分筆畫(huà)和原筆畫(huà)的色料拉曼光譜一定不一致，即使是使用了色料類型相同的筆，其色料成分也會(huì)因?yàn)槠放?、型?hào)的差異導(dǎo)致二者拉曼光譜圖不一致，從而區(qū)分開(kāi)來(lái)，但僅含炭黑的除外。

3 拉曼光譜筆跡鑒定方案

      拉曼光譜技術(shù)是一種無(wú)損傷、靈敏度高、操作簡(jiǎn)捷的測(cè)試手段，實(shí)驗(yàn)設(shè)備采用我公司的“Finder Vista”微曼系列顯微共聚焦拉曼光譜儀系統(tǒng)；激光器波長(zhǎng)為532nm；光譜儀參數(shù)：500焦距，600g/mm；掃描物鏡100X。采集時(shí)間與采集次數(shù)根據(jù)樣本的拉曼光譜情況而定。

      采用對(duì)比試驗(yàn)方案，檢測(cè)紅、藍(lán)、黑3組顏色的筆跡。實(shí)驗(yàn)采用不同廠家、品牌、型號(hào)的簽字筆。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 不同型號(hào)、不同品牌中性筆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

4 拉曼光譜分析

4.1 黑色中性筆的拉曼光譜分析

      實(shí)驗(yàn)時(shí)采用532nm激光器激發(fā)檢測(cè)3種型號(hào)的黑色中性筆。圖一中3組樣品分別代表了3中型號(hào)黑色中性筆的拉曼光譜。

圖1 黑色中性筆拉曼光譜圖

      從圖1中我們可以發(fā)現(xiàn)，黑色1、2、3號(hào)樣品的拉曼光譜之間存在著顯著差異。1、2號(hào)樣品位于高波段3000cm-1附近的拉曼峰存在顯著區(qū)別，1號(hào)樣品在該波段存在2個(gè)拉曼特征峰，分別為2896、2950 cm-1。而2號(hào)樣品只能檢測(cè)到2892 cm-1特征峰。3號(hào)樣品相較于1、2號(hào)樣品，是較為純凈的炭黑中性筆，只能檢測(cè)到位于1360、1590 cm-1附近的碳元素的拉曼特征峰。

這些光譜存在差異主要是由于不同型號(hào)的黑色中性筆油墨成分不盡相同，因此，拉曼特征峰也就有所差異。

圖2 紅色中性筆拉曼光譜圖

      不同品牌、不同型號(hào)的紅色中性筆拉曼光譜圖如圖2所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，紅色中性筆的拉曼特征峰基本相同，說(shuō)明3組物質(zhì)的組成物質(zhì)基本相似，但是，紅色1、2號(hào)樣品相較于3號(hào)樣品。拉曼特征峰較為明顯，說(shuō)明，1、2號(hào)樣所含的油墨成分較多。同時(shí)紅色3號(hào)樣品位于1100 cm-1附近的兩個(gè)特征峰缺失，其產(chǎn)生的原因仍值得繼續(xù)深入研究。

圖3 藍(lán)色中性筆拉曼光譜圖

      不同品牌、不同型號(hào)的藍(lán)色中性筆拉曼光譜圖如圖3所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色中性筆的拉曼特征峰峰位基本相同，說(shuō)明3組物質(zhì)的組成物質(zhì)基本相似，但是，拉曼特征峰的相對(duì)強(qiáng)度仍有一定區(qū)別。如位于1397 cm-1的拉曼特征在藍(lán)色2、3有很強(qiáng)的拉曼信號(hào)，而藍(lán)色1號(hào)樣該峰消失，表明該組分物質(zhì)藍(lán)色1號(hào)樣品種沒(méi)有添加。1210、1436、1457 cm-1的拉曼特征峰相對(duì)強(qiáng)度在3組樣品中也呈現(xiàn)類似現(xiàn)象，因此，這4組拉曼特征峰可以作為區(qū)分藍(lán)色中性筆的指標(biāo)之一。

5結(jié)論

      在法庭科學(xué)領(lǐng)域，物證檢驗(yàn)要求盡量無(wú)損檢材，與其它分析技術(shù)相比，拉曼光譜技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于其非破壞性和幾乎無(wú)需樣品制備，適合對(duì)未知固體、液體進(jìn)行快速無(wú)損分析，因此該技術(shù)在物證鑒定方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

      本次研究運(yùn)用Finder Vista 激光顯微拉曼光譜鑒定黑、紅、藍(lán)三種市面常見(jiàn)的中性筆，并取得了一定成果，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)紙張上的不同廠家、不同型號(hào)的中性筆進(jìn)行定性分析。拉曼光譜法準(zhǔn)確率高、分析速度快、圖譜易辨認(rèn)，特別是具有樣品用量少，無(wú)損傷檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，因此，在筆記鑒定領(lǐng)域具有很高的實(shí)用價(jià)值。

6參考文獻(xiàn)

[1] 徐徹, 湯純, 楊延勇. 顯微激光拉曼光譜法鑒別黑色圓珠筆油墨的初步研究[J]. 刑事技術(shù), 2000, 16（4）: 244-245.

[2] 林建成, 李開(kāi)開(kāi), 黃建同. 拉曼光譜技術(shù)檢驗(yàn)黑色簽字筆添改字跡研究[J]. 光散射學(xué)報(bào), 2014, 26（1）: 68-72.

（來(lái)源：北京卓立漢光儀器有限公司）

一、前言

Micro CT作為一種三維斷層掃描成像方法，可以根據(jù)植物不同組織對(duì)X線的吸收與透過(guò)率的不同，重建獲得植物組織的斷面或立體圖像，發(fā)現(xiàn)其中的細(xì)小組織結(jié)構(gòu)變化，從而無(wú)損探索植物各組織內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。因而在植物研究中，Micro CT的應(yīng)用也逐漸增多。

二、應(yīng)用

1.    根系

植物根系的分枝結(jié)構(gòu)是植物生命力的決定因素，根系的生長(zhǎng)形態(tài)與植物的土壤環(huán)境和植物的基因型息息相關(guān)，因此根系的3D形態(tài)學(xué)分析是評(píng)估不同植物競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的重要工具。由于植物的根生長(zhǎng)在各種不透明的媒介中，這成為限制觀察植物根系在土壤中的生長(zhǎng)情況的主要因素，是獲得原位的根系生長(zhǎng)情況的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)和障礙。傳統(tǒng)的洗根掃描法能夠清晰地展現(xiàn)根系，但卻破壞了其原有的狀態(tài)；微根窗法能夠解決原位測(cè)量的問(wèn)題，但卻無(wú)法展示探索土壤內(nèi)部的根系分布。

隨著Micro CT的發(fā)展和應(yīng)用，研究者們發(fā)現(xiàn)，利用Micro CT掃描可以無(wú)損地原位探索土壤中不同植物的根系變化，可以測(cè)量根系的3D結(jié)構(gòu)，獲取根系的形態(tài)學(xué)以及剖面等內(nèi)部性狀，是根系原位研究的重要工具。同時(shí)，根系的算法分割也一直是Micro CT根系原位掃描中需要突破的難點(diǎn)。

例1：平生公司的NEMO?Micro CT在原位狀態(tài)下掃描的水稻根系展示如下，通過(guò)CT 三維重建，可觀察到根系的完整拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并對(duì)其內(nèi)部剖面進(jìn)行觀察：

2.     種子

目前國(guó)際上使用的很多研究種子的先進(jìn)技術(shù)大多是利用熒光法研究種子活力或其萌發(fā)率，這些方法能夠高通量地達(dá)到某些研究目的，但始終無(wú)法得知種皮內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。

而種子內(nèi)部的形態(tài)學(xué)信息參數(shù)，以及胚芽和胚乳區(qū)域的瑕疵率等，是評(píng)估種子的出芽率和質(zhì)量的關(guān)鍵信息。傳統(tǒng)方法常采用內(nèi)窺鏡來(lái)分析種子內(nèi)部的形態(tài)，然而這種方法只能獲得有限的投影，受種子放置方位的影響，很多缺陷無(wú)法體現(xiàn)。

而Micro CT通過(guò)投影重建、三維成像功能，可提供種子的不同角度的觀察，對(duì)于種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)展現(xiàn)更加全面，例如裂隙、內(nèi)部萌芽情況評(píng)估、病蟲(chóng)害情況等等。

例2：以下是利用平生公司的NEMO?Micro CT對(duì)一粒水稻種子進(jìn)行掃描成像，并利用平生自己開(kāi)發(fā)的圖像分析軟件Avatar?進(jìn)行分析處理。在圖像中可清晰觀察到種皮，胚乳、胚牙等內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并可給出這些組織的體積分析結(jié)果。

例3：玉米種子（XX農(nóng)業(yè)大學(xué)提供樣本，NEMO? Micro CT掃描結(jié)果）

例4：麥穗（XXX植物基因研究ZX提供樣本，NEMO? Micro CT掃描結(jié)果）

3.  果實(shí)

使用Micro CT對(duì)果實(shí)的無(wú)損掃描，也可觀察到果實(shí)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究與蛀蟲(chóng)病檢測(cè)方面有極大的幫助。（Super Nova? Micro CT掃描結(jié)果）

4.    莖、葉

通過(guò)高分辨率的Micro CT系統(tǒng)的掃描，為研究植物莖流和植物水分方面提供更直觀的3D的觀測(cè)方式。（NEMO? Micro CT掃描結(jié)果）

三、        總述

由此可見(jiàn)，Micro CT不僅在活體動(dòng)物和離體組織的分析研究中具有重要的應(yīng)用，也在植物方面有著特殊的應(yīng)用價(jià)值。可廣泛應(yīng)用于植物種子三維結(jié)構(gòu)研究，無(wú)損探索種子腔體、胚和胚乳的變化；分析原位研究土壤中根系的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)；研究果實(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化；以及植物莖流和植物水分等。