眾所周知，多功能納米載體可以有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞并且在體外具有良好的抗腫瘤效果。但是目光轉(zhuǎn)向體內(nèi)，這些納米載體往往在免疫系統(tǒng)的攻擊下集體失靈。因?yàn)椋梭w免疫系統(tǒng)將會(huì)感知納米載體的入侵，并且非常努力的把我們精心設(shè)計(jì)的載體清除掉。一旦納米載體被清除掉，藥物就很難到達(dá)目標(biāo)腫瘤區(qū)域，很難實(shí)現(xiàn)殺傷腫瘤的效果。因此，納米醫(yī)學(xué)的一個(gè)非常重要的課題就是在不破壞免疫系統(tǒng)的前提下，讓納米載體躲避免疫系統(tǒng)的攻擊。

      傳統(tǒng)的解決方案我們都是通過(guò)在納米載體表面攜帶各種偽裝工具，盡量和免疫細(xì)胞捉迷藏，能躲則躲，絕不露面。但是這些載體也很容易迷路， 到達(dá)深層腫瘤部位的很少，并且在和免疫系統(tǒng)的斗智斗勇中，還會(huì)激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生新的抗體從而加速納米載體的清除，因此很難達(dá)到ZL的效果。而隨著仿生納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們可以讓納米載體穿上“吉利服”，不但可以在免疫系統(tǒng)中潛伏下來(lái)，還可以大搖大擺的從免疫細(xì)胞的眼皮底下蒙混過(guò)關(guān)，發(fā)揮極大功效。這種“吉利服”就是細(xì)胞膜提取物，不同種類(lèi)細(xì)胞提取的細(xì)胞膜包覆在納米載體表面還可以表現(xiàn)出特殊的功效，像紅細(xì)胞膜或者一些免疫細(xì)胞膜可以提高納米載體的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，腫瘤細(xì)胞膜可以特異識(shí)別同源腫瘤等。穿上“細(xì)胞膜吉利服”之后，納米載體將顯現(xiàn)各方面的優(yōu)勢(shì)和潛力，從而成為近年來(lái)多功能納米載體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

1、T細(xì)胞膜包裹下仿生納米藥物的免疫識(shí)別增強(qiáng)

      通過(guò)糖代謝技術(shù)，獲取嵌入疊氮基團(tuán)（N3）的功能化T細(xì)胞，并提取功能化T細(xì)胞膜包裹在吲哚菁綠/聚合物納米載體表面，構(gòu)建仿生納米光敏劑。功能化T細(xì)胞膜上不但原本的抗原受體可以賦予納米光敏劑識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力，并且N3基團(tuán)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞糖代謝靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)納米載體在腫瘤內(nèi)部的富集，通過(guò)小動(dòng)物光學(xué)成像可以清楚的看到T細(xì)胞膜包裹下仿生納米藥物在腫瘤部位的靶向作用，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤的jing準(zhǔn)可視化ZL。

功能化T細(xì)胞膜仿生納米顆粒實(shí)現(xiàn)特異性的腫瘤靶向和jing準(zhǔn)光熱ZL

參考文獻(xiàn)：T Cell Membrane Mimicking Nanoparticles with Bioorthogonal Targeting and Immune Recognition for Enhanced Photothermal Therapy.  Advanced Science. 2019: 1900251.

2、生物學(xué)重編程全抗原細(xì)胞膜助力納米疫苗的研發(fā)

      將腫瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞融合細(xì)胞的生物學(xué)重編程細(xì)胞膜包覆在金屬有機(jī)化合物表面，構(gòu)建腫瘤疫苗可以在融合細(xì)胞膜表面表達(dá)大量免疫刺激分子，從而使得包裹融合細(xì)胞膜的納米載體像抗原呈遞細(xì)胞一樣直接作用T細(xì)胞從而激活免疫反應(yīng)。通過(guò)小動(dòng)物光學(xué)成像，可以看到重編程細(xì)胞膜包覆的納米載體在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)到達(dá)腫瘤部位的過(guò)程。到達(dá)腫瘤部位的納米載體還可以被樹(shù)突細(xì)胞識(shí)別，從而誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟，增強(qiáng)免疫效果，Z終消除腫瘤，從而拓展腫瘤ZL平臺(tái)。

生物學(xué)重編程細(xì)胞膜包裹納米載體的過(guò)程以及腫瘤免疫的激活

參考文獻(xiàn)： Cytomembrane nanovaccines show therapeutic effects by mimicking tumor cells and antigen presenting cells. Nature Communications. 2019, 10(1): 3199.

3、腫瘤細(xì)胞膜包裹的黑磷納米載體拓寬光熱腫瘤免疫ZL

      手術(shù)切除的腫瘤組織含有對(duì)患者特異性的新抗原，是成為制備個(gè)體化腫瘤疫苗Z好的材料來(lái)源。作者利用細(xì)胞膜封裝的方式在二維光熱黑磷量子點(diǎn)（BPQDs）表面包裹腫瘤組織的細(xì)胞膜，從而制備具有光熱效應(yīng)的納米腫瘤疫苗(BPQD-CCNVs)，并且把納米腫瘤疫苗和集落刺激因子（GM-CSF）裝入熱敏水凝膠中。皮下注射水凝膠后可以在紅外光的作用下持續(xù)釋放納米疫苗以及集落刺激因子，招募并激活DC細(xì)胞，從而捕獲腫瘤抗原并激活腫瘤特異性T細(xì)胞。同時(shí)，尾靜脈注射PD-1YZ劑，阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)通路，增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)。通過(guò)活體光學(xué)成像我們可以對(duì)腫瘤進(jìn)行生物發(fā)光標(biāo)記，從而長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤在體內(nèi)的發(fā)展情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)光熱免疫ZL可以有效清除實(shí)體腫瘤同時(shí)YZ術(shù)后轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)。

(A)光熱腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路；

(B)FITC標(biāo)記的水凝膠在體內(nèi)的降解情況；

(C)個(gè)性化光熱腫瘤免疫ZL可以有效YZ術(shù)后實(shí)體腫瘤的復(fù)發(fā)；

(D)個(gè)性化光熱腫瘤免疫ZL可以有效YZ術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：Surgical Tumor-Derived Personalized Photothermal Vaccine Formulation for Cancer Immunotherapy. ACS nano. 2019, 13(3): 2956-2968.

珀金埃爾默擁有先進(jìn)的分子影像技術(shù)，其小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)為生物醫(yī)學(xué)的各種研究領(lǐng)域（包括腫瘤、干細(xì)胞、傳染病、炎癥、免疫性疾病、神經(jīng)疾病、心血管疾病、代謝疾病、基因ZL、納米材料、新藥研發(fā)、植物學(xué)等）提供了完整的成像解決方案。

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在往期分享中，我們介紹了IVIS成像系統(tǒng)在動(dòng)物水平的眾多應(yīng)用，其實(shí)IVIS同樣可以用于全植物成像。此次我們就分享IVIS在水稻氮代謝研究中的應(yīng)用。

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的養(yǎng)分，但其在土壤中的濃度往往達(dá)不到Z佳作物生長(zhǎng)濃度。因此，提高作物氮素利用率被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個(gè)主要目標(biāo)。然而，關(guān)于作物氮代謝仍有許多需要了解的地方。

在此，研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)分子傳感器系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)水稻中氮的狀態(tài)，該方法發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》雜志上。研究中首先利用該系統(tǒng)研究了尿囊素的作用，尿囊素分解為尿囊素衍生的代謝物，在低濃度下作為氮源使用。參與尿素代謝的兩個(gè)基因尿囊素酶(OsALN)和尿素滲透酶1 (OsUPS1)，對(duì)氮狀態(tài)高度敏感，在低氮條件下，OsALN迅速上調(diào)，而高氮條件下OsUPS1表達(dá)上調(diào)?；谏鲜鰴C(jī)制，研究人員培育了含有氮分子傳感器系統(tǒng)的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]轉(zhuǎn)基因水稻。這種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以模擬內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即OsALN和OsUPS1基因?qū)ν庠碞狀態(tài)的響應(yīng)。

文中使用兩種方法來(lái)測(cè)定分子氮傳感器的能力：

方法一：在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株在高濃度氮源培養(yǎng)基(GM+N)或不含氮源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM-N)中培養(yǎng)5天，隨后使用IVIS活體成像系統(tǒng)進(jìn)行成像及定量。

結(jié)果顯示，生長(zhǎng)在GM+N培養(yǎng)基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表現(xiàn)出更高的熒光素酶活性（圖1A）。為了對(duì)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行定量，研究人員測(cè)定了5個(gè)獨(dú)立的純合系（具有單個(gè)基因拷貝）。生長(zhǎng)在GM+N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株發(fā)光信號(hào)強(qiáng)于GM-N組20倍，而強(qiáng)于對(duì)照組約2,800倍（圖1B）。

方法二：在短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株先在GM-N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，第5天在加入100nM硫酸銨。結(jié)果顯示，同長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，生長(zhǎng)在后期加 氮培養(yǎng)基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，發(fā)光信號(hào)更強(qiáng)（圖1C）。同樣對(duì)5株獨(dú)立的純合系進(jìn)行了定量，生長(zhǎng)在后期加N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)于GM-N培養(yǎng)基中約50倍，而強(qiáng)于對(duì)照組13,000倍（下圖1D）。

圖1.在高氮培養(yǎng)條件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)。

(A)對(duì)照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培養(yǎng)基 中培養(yǎng)5天；

(B)5個(gè)獨(dú)立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)條件下，發(fā)光定量結(jié)果；

(C)對(duì)照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生長(zhǎng)5天, 或者在GM–N培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4天，然后加入100 mM硝酸銨培養(yǎng)1天；

(D)5個(gè)獨(dú)立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)條件下的定量結(jié)果，以對(duì)照組作為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化 。

這些結(jié)果說(shuō)明，proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器能夠通過(guò)發(fā)光信號(hào)水平檢測(cè)外源氮的情況。

同樣在研究中對(duì)proALN::ALN-LUC2 植株進(jìn)行了相同的處理。結(jié)果顯示，在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，GM+N和GM-N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的proALN::ALN-LUC2 沒(méi)有明顯差異（圖2A）。對(duì)5株獨(dú)立的純品系進(jìn)行發(fā)光信號(hào)定量，相比GM+N培養(yǎng)基，GM-N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的proALN::ALN-LUC2 植株發(fā)光信號(hào)要高約1.8倍，比對(duì)照組高約17倍（圖2B）。因此很難鑒定GM+N和GM-N培養(yǎng)基對(duì)生長(zhǎng)的影響。而在短時(shí)間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)生長(zhǎng)在GM-N培養(yǎng)基中的proALN::ALN-LUC2，發(fā)光信號(hào)要強(qiáng)于加高氮培養(yǎng)1天的。

圖2.在低氮培養(yǎng)條件下，proALN::ALN-LUC2 植株顯示強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)。

(A)對(duì)照組和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng).；

(B)A組相對(duì)定量結(jié)果；

(C)對(duì)照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培養(yǎng)5天，或者在GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，然后加入100 mM 硝酸銨再培養(yǎng)1天 ；

(D)C組相對(duì)定量結(jié)果；GM–N培養(yǎng)基生長(zhǎng)的對(duì)照組植株作為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

此外，在文章中，還利用IVIS活體成像系統(tǒng)，探討了該傳感器對(duì)于氮源是否具有選擇性及對(duì)于氮源的敏感性。結(jié)果顯示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 對(duì)于氮源無(wú)特異性，可以廣泛的作為水稻等植株中分子氮的傳感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀濃度> 1mM即表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)，而低氮濃度(< 0.01mM)信號(hào)減弱。0.1mM硝酸鉀proUPS1:: UPS1-LUC2 植株誘導(dǎo)強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)，而0.1mM硝酸銨和硫酸銨則沒(méi)有。這表明， proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器監(jiān)測(cè)高氮狀態(tài)，低氮狀態(tài)。proALN::ALNLUC2 在低氮濃度(<0.1 mM)下表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光素酶活性，而在高氮濃度下表現(xiàn)出較弱的活性(> 10mM)。

綜上，分子氮傳感器的信號(hào)反映了分子氮的內(nèi)部狀態(tài)。結(jié)合IVIS活體成像技術(shù)，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作為分子傳感器在不同研究中監(jiān)測(cè)大米內(nèi)部氮狀態(tài)。

文獻(xiàn)來(lái)源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.

腫瘤在體內(nèi)只有一個(gè)目標(biāo)，就是不停地生長(zhǎng)！生長(zhǎng)！生長(zhǎng)！在生長(zhǎng)的過(guò)程中不可避免的要消耗掉大量的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以腫瘤會(huì)構(gòu)建自身的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)用于養(yǎng)分和氧氣的輸送，這些腫瘤內(nèi)部搭建的血管就是腫瘤的能量供應(yīng)站。因此切斷腫瘤的主動(dòng)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，破壞腫瘤的能量代謝系統(tǒng)，就能YZ腫瘤細(xì)胞的增殖，從而“餓死”癌細(xì)胞。

但是，這種能量切斷不是廣義上的讓病人減少進(jìn)食，或者少吃營(yíng)養(yǎng)的東西，這樣會(huì)使正常組織得不到足夠的能量導(dǎo)致免疫力下降。真正的饑餓療法具有選擇性，可以特異性的YZ腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程（圖1），實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的jing準(zhǔn)致命打擊。

圖1 特異性YZ腫瘤細(xì)胞能量代謝

級(jí)聯(lián)納米酶靶向腫瘤“饑餓”環(huán)境

通過(guò)級(jí)聯(lián)納米催化藥物的設(shè)計(jì)，將葡萄糖氧化酶(GOx)和過(guò)氧化氫酶(CAT)通過(guò)pH響應(yīng)的聚合物交聯(lián)形成級(jí)聯(lián)納米酶，通過(guò)血清蛋白將納米酶和抗腫瘤前藥復(fù)合形成納米藥物。腫瘤的酸性環(huán)境可以將納米酶釋放，COx迅速消耗腫瘤細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和氧氣，產(chǎn)生饑餓和缺氧環(huán)境，切斷腫瘤能量供應(yīng)的同時(shí)提升前藥系統(tǒng)的化學(xué)治LX果，并且消耗葡萄糖產(chǎn)生的毒副產(chǎn)物H₂O₂也可以快速被CAT分解，以避免產(chǎn)生全身毒性。這種結(jié)合靶向饑餓環(huán)境并結(jié)合缺氧化學(xué)ZL的方案可以有效YZ腫瘤細(xì)胞的增殖，不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，通過(guò)小動(dòng)物光學(xué)成像可以清楚的看到級(jí)聯(lián)納米酶顆粒在腫瘤部位的富集隨時(shí)間的變化情況，以及48小時(shí)后納米酶顆粒在各個(gè)臟器中的分布情況。

圖2 基于級(jí)聯(lián)納米酶的納米藥物設(shè)計(jì)以及在體內(nèi)的靶向分布情況

參考文獻(xiàn)

Ma Y, Zhao Y, Bejjanki N K, et al. Nanoclustered Cascaded Enzymes for Targeted Tumor Starvation and Deoxygenation-Activated Chemotherapy without Systemic Toxicity[J]. ACS nano, 2019, 13(8): 8890-8902.

光照誘導(dǎo)腫瘤能量代謝阻斷

通過(guò)新型納米顆粒的構(gòu)建，利用腫瘤細(xì)胞高表達(dá)組織蛋白酶B的特性，設(shè)計(jì)酶剪切開(kāi)關(guān)，將載有光敏劑的介孔納米硅和和定位序列修飾的氧化鎢顆粒偶聯(lián)在一起形成行星-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)。被腫瘤細(xì)胞攝取后納米顆?？梢员桓弑磉_(dá)的組織蛋白酶B剪切，行星-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)分開(kāi)，配合不同波段的光照同時(shí)引發(fā)光動(dòng)力和光熱效應(yīng)，切斷腫瘤氧化磷酸化和糖酵解過(guò)程，阻斷能量供應(yīng)，YZ腫瘤的增殖。通過(guò)小動(dòng)物活體光學(xué)成像進(jìn)行肝部轉(zhuǎn)移腫瘤的體內(nèi)表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種納米顆粒配合光照可以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生“饑餓”環(huán)境，通過(guò)YZ腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)清除體內(nèi)的轉(zhuǎn)移腫瘤。而正常細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶B含量不足，行星-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)無(wú)法分開(kāi)，在光照過(guò)程中光動(dòng)力產(chǎn)生的單線態(tài)氧可以進(jìn)一步氧化納米氧化鎢顆粒，阻礙光熱反應(yīng)的發(fā)生，不會(huì)影響到正常組織的代謝過(guò)程，證實(shí)了可以基于能量代謝的腫瘤選擇性jing準(zhǔn)ZL策略的可行性。

圖3 光照切斷腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)

參考文獻(xiàn)

Huo D, Zhu J, Chen G, et al. Eradication of unresectable liver metastasis through induction of tumour specific energy depletion[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-17.

早在幾十年前，研究者們首次發(fā)現(xiàn)，外源的mRNA經(jīng)肌肉注射至小鼠體內(nèi)后有相應(yīng)的蛋白表達(dá)，這也成為了mRNA疫苗的雛形。人們一直以來(lái)都希望能夠生產(chǎn)出一種靈活、易于生產(chǎn)、安全有效的疫苗。而mRNA疫苗就是一種可以滿足這些需求的，具有良好的發(fā)展前景的新疫苗。而時(shí)至今日，在新冠疫情的背景下，mRNA疫苗也不負(fù)重望的成為了一顆耀眼的明星，輝瑞、Moderna等公司的mRNA新冠疫苗相繼展現(xiàn)出了良好的預(yù)防效果，使得mRNA疫苗愈發(fā)受到人們的關(guān)注。
而合適的mRNA遞送載體一直是制約mRNA疫苗發(fā)展的一大瓶頸，一個(gè)合適的mRNA遞送載體可實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的GX包載，并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的表達(dá)效果。目前常用的幾種mRNA遞送載體主要包括：聚合物材料、多肽、脂質(zhì)納米粒。下面我們就簡(jiǎn)要介紹一下這幾種mRNA遞送載體。


（一） 聚合物材料

早期人們采用聚合物材料來(lái)進(jìn)行核酸的遞送，如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、聚氨基酯（PBAE）、殼聚糖等。大多數(shù)用于mRNA遞送的聚合物材料都需要進(jìn)行脂肪酸鏈的修飾，以改善其安全性，但這些材料的應(yīng)用目前都只停留在臨床前研發(fā)階段。有研究就采用PEI用于將DNA通過(guò)吸入的方式輸送到肺部。然而PEI不易分解，因此對(duì)于可能需要的重復(fù)給藥，聚合物可能累積并引起副作用?！?】也有研究采用分支型的聚胺基聚合物進(jìn)行mRNA的包載，構(gòu)建一套樹(shù)狀聚合物RNA納米粒，并成功在體內(nèi)表達(dá)出了對(duì)抗翟卡病毒、埃博拉病毒的相關(guān)抗體。【2】

圖1. 麻省理工研究團(tuán)隊(duì)采用

聚合物材料制備的mRNA納米?！?】

（二） 多肽

也有少量的研究中采用了細(xì)胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs）用于mRNA的遞送，如采用包含有兩親性序列精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（Arg-Ala-Leu-Ala）的細(xì)胞穿膜肽來(lái)結(jié)合mRNA構(gòu)建成一種CPP-mRNA復(fù)合納米粒，其可以發(fā)揮CPP跨越細(xì)胞膜的能力，將mRNA很好的遞送到細(xì)胞內(nèi)，并引發(fā)了良好的T細(xì)胞應(yīng)答?！?】

（三）脂質(zhì)納米粒

人們采用離子化的脂質(zhì)進(jìn)行siRNA的遞送，并在2018年由Alnylam制藥公司推出了上市的RNAi藥物Onpattro，其就是通過(guò)離子化的脂質(zhì)制備的脂質(zhì)納米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）進(jìn)行siRNA的包載和遞送。受其啟發(fā)，目前研究者們也紛紛選擇LNPs作為mRNA遞送的載體。LNPs主要通過(guò)陽(yáng)離子的磷脂材料與其他輔助磷脂完成顆粒的構(gòu)建，通過(guò)RNA所帶的負(fù)電與陽(yáng)離子磷脂的正電相互吸附，可實(shí)現(xiàn)較高的包載效果，并且在體內(nèi)由低密度脂蛋白介導(dǎo)的胞吞機(jī)制可使納米粒子成功被細(xì)胞攝取，實(shí)現(xiàn)良好的細(xì)胞攝取效果。在胞內(nèi)經(jīng)由內(nèi)含體途徑將mRNA成功釋放，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白表達(dá)。同時(shí)良好的體內(nèi)安全性也使他更具競(jìng)爭(zhēng)力，在多種傳染性疾病的預(yù)防及ZL方面展現(xiàn)出了較好的效果。其中已有大量的研究已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究階段，如在兩項(xiàng)臨床一期的流感病毒疫苗研究中，通過(guò)LNPs包載核苷酸修飾的mRNA，所產(chǎn)生的機(jī)體免疫應(yīng)答與傳統(tǒng)的滅活流感病毒疫苗相似，并且安全性也基本一致?！?】在新冠疫情的背景下，輝瑞與Biotech的mRNA疫苗更是緊急上市，同樣采用LNPs作為mRNA的遞送載體，并展現(xiàn)出了超過(guò)90%的有效率。

圖3. 常見(jiàn)的LNPs構(gòu)造

目前在多種mRNA遞送載體中，LNPs還是更優(yōu)的選擇，但是如何開(kāi)發(fā)出新的配方材料，打破相關(guān)ZL壁壘，同樣是相關(guān)研究者爭(zhēng)相努力的方向。同時(shí)伴隨著RNA序列編輯、RNA的大批量快速生產(chǎn)等相關(guān)研究的進(jìn)一步發(fā)展，未來(lái)mRNA疫苗相關(guān)技術(shù)會(huì)愈發(fā)成熟，會(huì)引領(lǐng)接下來(lái)一段時(shí)間的藥物研發(fā)相關(guān)的風(fēng)潮。
 

參考文獻(xiàn)：

1. James Cliff Kaczmarek, Kevin J Kauffman et al.: Optimization of a Degradable Polymer-Lipid Nanoparticle for Potent Systemic Delivery of mRNA to the Lung Endothelium and Immune Cells. Nano Lett 2018, DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b02917.

2. Chahal JS, Khan OF, Cooper CL et al.:Dendrimer-RNA nanoparticles generate protective immunity against lethal Ebola, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii challenges with a single dose. Proc Natl Acad Sci USA 2016,113:E4133-4142.

3. Udhayakumar VK, De Beuckelaer A et al.: Arginine-rich peptide-based mRNA nanocomplexes efficiently instigate cytotoxic T cell immunity dependent on the amphipathic organization of the peptide. Adv Healthc Mater 2017, 6.

4. Feldman RA, Fuhr R et al.: mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials. Vaccine 2019, 37:3326-3334.

納米藥物制備系統(tǒng)

應(yīng)用范圍：

隨著生活水平和YL衛(wèi)生狀況的不斷提升，寄生蟲(chóng)感染在我們?nèi)粘Ｉ钪兴坪跻讶諠u陌生。但在一些欠發(fā)達(dá)地區(qū)，由于貧困和不良的衛(wèi)生習(xí)慣造成的寄生蟲(chóng)感染仍然威脅著無(wú)數(shù)生命。隱孢子蟲(chóng)作為一種常見(jiàn)的人畜共患寄生蟲(chóng)感染性疾病，是導(dǎo)致腹瀉病的主要原因。由于其經(jīng)由糞便傳播，所以常經(jīng)由水體污染而在衛(wèi)生條件較差的地區(qū)發(fā)生群體性感染。感染通常是自限性的，健康的成年人在發(fā)生第 一階段的較嚴(yán)重的腹瀉之后便可恢復(fù)，但糞便仍可能具有傳染性。新生兒或免疫力低下的如艾滋病患者或經(jīng)免疫YZZL的病人在感染后病情較嚴(yán)重，是兒童早期死亡、營(yíng)養(yǎng)不良和生長(zhǎng)遲緩的重要原因，也是艾滋病人并發(fā)腹瀉死亡的主要原因。

現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲(chóng)共有15個(gè)亞種，分別感染人、家禽、寵物、牲畜以及一些野生動(dòng)物。由于不了解其致病機(jī)制，目前的ZL方案往往是對(duì)癥用藥而非對(duì)因用藥。由于不同物種間感染模式差異，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(主要為牛等家畜)上應(yīng)對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染的有效疫苗往往對(duì)預(yù)防人的感染收效甚微。

針對(duì)以上問(wèn)題，來(lái)自美國(guó)賓大獸醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種可用在小鼠模型中模擬與人患隱孢子蟲(chóng)病相似病癥的隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium tyzzeri), 同時(shí)利用IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)幫助他們?cè)隗w研究隱孢子蟲(chóng)的感染以及宿主經(jīng)寄生蟲(chóng)或疫苗免疫激活后的抗感染現(xiàn)象。該研究于近期發(fā)表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。

要在小鼠體內(nèi)模擬人患隱孢子蟲(chóng)病的合理模型，首先就需要找到相應(yīng)的隱孢子蟲(chóng)。作者在農(nóng)場(chǎng)收集了大量小家鼠糞便，經(jīng)由測(cè)序，鑒定出一株與感染人的兩種隱孢子蟲(chóng)(C. parvum和C. hominis)Z接近的一種鼠隱孢子蟲(chóng)(C. tyzzeri)。同時(shí)為了后續(xù)在體觀察其感染模式以及宿主抗感染效果，作者通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)將Luciferase基因和mCherry熒光蛋白導(dǎo)入到隱孢子蟲(chóng)的基因組中，構(gòu)建了一株可以進(jìn)行活體以及顯微觀察的隱孢子蟲(chóng)。

圖一C. tyzzeri的鑒定以及基因編輯 (上：隱孢子蟲(chóng)種間基因組相似性比較，AB為常見(jiàn)感染人的兩種隱孢子蟲(chóng)，C為常見(jiàn)感染鼠的隱孢子蟲(chóng))

構(gòu)建好的隱孢子蟲(chóng)就可以進(jìn)行活體觀察了，由于有活力的隱孢子蟲(chóng)可以表達(dá)Luciferase，在底物熒光素的作用下便可自發(fā)熒光，通過(guò)IVIS活體成像系統(tǒng)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)隱孢子蟲(chóng)的繁殖情況。作者將這一光學(xué)觀察方式與傳統(tǒng)的糞便qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，二者具有很好的一致性。作者除了觀察到這一新鑒定的隱孢子蟲(chóng)感染和人患隱孢子蟲(chóng)病的感染部位以及病理表征一致之外，還觀察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隱孢子蟲(chóng)的危害，這一點(diǎn)與臨床上免疫缺陷病人的高發(fā)病致死率也剛好吻合。

圖二  C. tyzzeri感染模式觀察

有了這一能夠很好模擬人隱孢子蟲(chóng)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之后，便可以利用這一模型進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)的ZL以及疫苗的開(kāi)發(fā)。由于臨床上隱孢子蟲(chóng)高發(fā)地區(qū)人們?cè)诟腥救笤俣雀腥镜母怕蚀蟠蠼档?，因此作者首先檢驗(yàn)了蟲(chóng)體是否可以直接作為疫苗來(lái)進(jìn)行感染的預(yù)防。利用未經(jīng)Luciferase標(biāo)記的C. tyzzeri進(jìn)行第 一次感染，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組使用滅活的蟲(chóng)體作為疫苗進(jìn)行第 一次免疫，在感染后用廣譜抗蟲(chóng)藥巴龍霉素殺滅后用Luc標(biāo)記C. tyzzeri進(jìn)行二次感染，能夠觀察到接觸活蟲(chóng)的小鼠幾乎不會(huì)發(fā)生二次感染，而使用滅活蟲(chóng)體作為疫苗無(wú)法激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的抗感染作用。

圖三 使用滅活的C. tyzzeri無(wú)法預(yù)防感染

因此作者想到可以使用減毒的活蟲(chóng)對(duì)宿主進(jìn)行第 一次免疫。通過(guò)射線進(jìn)行寄生蟲(chóng)減毒處理，可以降低其感染力至無(wú)害水平。在減毒活蟲(chóng)感染后30天，在使用Luc標(biāo)記的C. tyzzeri進(jìn)行感染，能夠觀察到該方法與野生型活蟲(chóng)二次感染模型有著相同的抗感染作用，說(shuō)明減毒的疫苗是一種行之有效的預(yù)防隱孢子蟲(chóng)感染的方式。但是由于要調(diào)動(dòng)自身免疫系統(tǒng)，這一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。

圖四 使用減毒疫苗可以有效對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行預(yù)防

雖然這篇文章也并未真正解決隱孢子蟲(chóng)的抗感染問(wèn)題，但是構(gòu)建出針對(duì)這一寄生蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)小鼠模型已經(jīng)為后續(xù)的科研工作者嘗試更多ZL方案和預(yù)防措施提供了可操作可監(jiān)控的實(shí)驗(yàn)工具。

參考文獻(xiàn)

1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00

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珀金埃爾默致力于為創(chuàng)建更健康的世界而持續(xù)創(chuàng)新。我們?yōu)樵\斷、生命科學(xué)、食品及應(yīng)用市場(chǎng)推出獨(dú)特的解決方案，助力科學(xué)家、研究人員和臨床醫(yī)生解決Z棘手的科學(xué)和YL難題。憑借深厚的市場(chǎng)了解和技術(shù)專(zhuān)長(zhǎng)，我們助力客戶更早地獲得更準(zhǔn)確的洞見(jiàn)。在，我們擁有12500名專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，服務(wù)于150多個(gè)國(guó)家，時(shí)刻專(zhuān)注于幫助客戶打造更健康的家庭，改善人類(lèi)生活質(zhì)量。2018年，珀金埃爾默年?duì)I收達(dá)到約28億美元，為標(biāo)準(zhǔn)普爾500指數(shù)中的一員，紐交所上市代號(hào)1-877-PKI-NYSE。

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腫瘤異質(zhì)性及轉(zhuǎn)移性

人類(lèi)大多數(shù)腫瘤是異質(zhì)性的，由具有不同性質(zhì)的細(xì)胞克隆組成，呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。高度異質(zhì)性腫瘤具有較差的臨床LX，但其潛在機(jī)制仍不清楚。腫瘤的轉(zhuǎn)移性是大多數(shù)癌癥患者死亡的原因。因此，了解轉(zhuǎn)移進(jìn)程的驅(qū)動(dòng)因子是改善臨床結(jié)果的關(guān)鍵。

癌癥基因組測(cè)序研究已經(jīng)確定了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間具有極小的遺傳差異，并顯示原位腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶具有顯著的亞克隆異質(zhì)性。Z近的一些研究表明：微觀環(huán)境變化是腫瘤轉(zhuǎn)移傳播和生長(zhǎng)的主要媒介，從而突出了在腫瘤進(jìn)展中的非細(xì)胞自發(fā)因子的作用。

本期IVIS視角小編帶您探究一下NatureZ近發(fā)表的論文：《亞克隆合作通過(guò)修飾局部和全身的免疫微觀環(huán)境驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移》

本文揭示了表達(dá)IL11和FIGF (VEGFD)的乳腺癌細(xì)胞的小亞克隆協(xié)同作用促進(jìn)轉(zhuǎn)移進(jìn)展并產(chǎn)生了驅(qū)動(dòng)性和中性亞克隆組成的多克隆轉(zhuǎn)移。單克隆、多克隆原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)譜分析顯示了這種協(xié)同作用是間接的，是通過(guò)局部和系統(tǒng)微環(huán)境介導(dǎo)的。作者確定中性粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞群受表達(dá)IL11小亞克隆的調(diào)節(jié)，敲除中性粒細(xì)胞的表達(dá)，可以阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)。來(lái)自原發(fā)性腫瘤、血液和肺的CD45陽(yáng)性細(xì)胞群的單細(xì)胞RNA-seq顯示IL11作用于骨 髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，可誘導(dǎo)產(chǎn)生致瘤性和轉(zhuǎn)移性中性粒細(xì)胞前體。本文結(jié)合IVIS活體成像系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)了非細(xì)胞自發(fā)因子和小亞克隆在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。

探究驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移的亞克隆協(xié)同作用分子機(jī)制

本文用人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞系(MDAMB-468)的腫瘤（來(lái)源于異質(zhì)性腫瘤異種移植模型），研究亞克隆在腫瘤表型之間的相互作用。作者之前已經(jīng)證實(shí)一個(gè)小的亞克隆通過(guò)非細(xì)胞自主的相互作用可以驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)。本文測(cè)試了18個(gè)亞克隆，每一種表達(dá)一種與轉(zhuǎn)移和血管再生有關(guān)的分泌蛋白。并發(fā)現(xiàn)具有全部18個(gè)亞克隆的多克隆腫瘤生長(zhǎng)Z快（上圖a）。相反只有白細(xì)胞介素11 (IL11) 和趨化因子 (C-C motif) 配體5在單克隆腫瘤能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。我們還確定了表達(dá)IL11和低聚果糖誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子（FIGF也被稱(chēng)為VEGFD）的亞克隆兩者的混合物在很大程度上能夠復(fù)制腫瘤這種生長(zhǎng)特點(diǎn)。

克隆之間合作導(dǎo)致多克隆轉(zhuǎn)移

Nature Cell Biology :Published: 01 July 2019

https://www.nature.com/articles/s41556-019-0346-x

IL11缺失的多克隆腫瘤阻止了腫瘤的生長(zhǎng)，揭示了IL11和FIGF因子在腫瘤生長(zhǎng)中的協(xié)同作用。此外，多克隆腫瘤和僅包括IL11和FIGF亞克隆的腫瘤具有高度的轉(zhuǎn)移性（上圖b）。

本文首先驗(yàn)證含有IL11+和FIGF+驅(qū)動(dòng)因子的原發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤MDA-MB-468的克隆能力，像中性子亞克隆。單克隆或綠色熒光蛋白 (GFP)的多克隆混合物熒光素酶表達(dá)親本細(xì)胞，紅色熒光蛋白 (RFP)植入v5標(biāo)記的IL11+細(xì)胞、RFP+FIGF+細(xì)胞植入到免疫缺陷NOG小鼠的乳腺脂肪墊。我們每周用卡尺測(cè)量原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)情況并通過(guò)每周生物發(fā)光觀察轉(zhuǎn)移病灶成像。多克隆腫瘤（含5% IL11+、5%的FIGF+RFP+細(xì)胞和90%的GFP+親本細(xì)胞）生長(zhǎng)較快，轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)與單克隆和親本腫瘤相比（如下圖a）。

中性粒細(xì)胞的系統(tǒng)性表達(dá)降低YZ了由IL11+和FIGF+亞克隆驅(qū)動(dòng)的多克隆腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散(或生長(zhǎng))，因此，中性粒細(xì)胞的表型和功能特點(diǎn)取決于宿主環(huán)境。

CD45+細(xì)胞群的單細(xì)胞分析

鑒于作者之前的結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。作者比較了DOX+或DOX-誘導(dǎo)小鼠血液和肺中性粒細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特點(diǎn)。IL11和FIGF誘導(dǎo)上調(diào)了幾個(gè)信號(hào)通路如：TGFβ和JAK-STAT信號(hào)通路，它們與中性粒細(xì)胞的免疫系統(tǒng)中腫瘤預(yù)生成和預(yù)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這些特征來(lái)自肺部，而不是來(lái)自血液。盡管中性粒細(xì)胞在肺部有變化，作者通過(guò)single-cell RNA-seq沒(méi)有檢測(cè)到IL11或GIGF受體的表達(dá)。然而，IL11RA的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本在單獨(dú)的細(xì)胞組中明顯存在，這些細(xì)胞不能歸為中性粒細(xì)胞或其他白細(xì)胞亞群。

這些IL11RA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)編碼GP130和SATA3的IL6ST基因，GP130是IL11信號(hào)通路中所必需的共同受體。STAT3是LI11下游的作用因子?；诩?xì)胞群中基因表達(dá)情況，其中還包括細(xì)胞外基質(zhì)和發(fā)育相關(guān)蛋白，作者將該群體標(biāo)記為和IL11反應(yīng)的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MStrCs)。雖然這個(gè)群體沒(méi)有表達(dá)典型的間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)標(biāo)記物，但其表現(xiàn)了普遍存在于干細(xì)胞相關(guān)基因的顯著特征，這表明它可能是一種未特征化的間充質(zhì)干細(xì)胞前體。之前的研究已經(jīng)描述過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞與白細(xì)胞之間的相互作用由多種細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)的。

在本文的研究中，作者著重于研究?jī)蓚€(gè)分泌因子，選擇的基礎(chǔ)是基于作者之前的數(shù)據(jù)，它是由較小的亞克隆表達(dá)的且協(xié)同作用促進(jìn)轉(zhuǎn)移。IL11屬于IL6家族的細(xì)胞因子，并在多種癌癥的耐藥性進(jìn)展中起著重要的作用，包括前列腺癌和結(jié)腸癌。在乳腺癌中，IL11被認(rèn)為和ZL的耐藥性和骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，以及作為不良預(yù)后的標(biāo)志物。FIGF是VEGFR2和VEGFR3的配體，可以刺激血管生成和淋巴管生成。

本文發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞可能不是IL11直接作用的細(xì)胞靶點(diǎn)，但可通過(guò)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞分泌因子（MStrCs）間接影響IL11。有趣的是，這些基質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)PLXDC2和ANTXR1，這在腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞中是高表達(dá)的。因此，這些IL11RA陽(yáng)性的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可能是產(chǎn)生多種細(xì)胞類(lèi)型的祖細(xì)胞。對(duì)中性粒細(xì)胞亞型的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的中性粒細(xì)胞靶向工具結(jié)合抗腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)的藥物，有可能被用于預(yù)防乳腺癌轉(zhuǎn)移研究。

PerkinElmer IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在該研究中提供了支持，如需了解詳情歡迎與我們的工程師取得聯(lián)系。

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