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  iwaihpnf380326 2009-04-03 00:00:00

  我Z近也是很苦惱于尋找能有效和蛋白質(zhì)結(jié)合的配體。 我選擇性的發(fā)幾個利用與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生絡(luò)合物或沉淀來測定蛋白質(zhì)的方法，希望能對你有啟發(fā)： 2．雙縮尿法（Biuret法） 雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有許多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵（—CO—NH—），因此，蛋白質(zhì)都可以與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)而使溶液呈現(xiàn)紫色[9]。 3．Folin-酚試劑法（Lowry法） Folin—酚試劑法Z早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。Q& _: 4．考馬斯亮蘭法（Bradford法） 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的Z大吸收峰的位置（λmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 6.BCA法 Bicinchoninic acid (BCA二喹啉甲酸)法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。 7水楊酸比色法 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

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