2.保留時間問題

2. 保留變量（時間變動）

如果所有峰（色譜峰）的保留時間均發(fā)生了變化，其致因很可能是如下因素發(fā)生了變化：流動相的組成、色譜柱的化學性質、色譜柱的溫度或流速。

如果等度或梯度流動相在在線式混合中出現(xiàn)錯誤，也可能導致保留時間出現(xiàn)問題。

下面將簡要介紹這些問題來源（對上述每個原因都簡述如下）。

2.1.如果操作人員操作不當，則會導致流動相組成的意外變化，例如使用在線式混合系統(tǒng)時，流動相混合物（系統(tǒng)）設置不正確；或替換新批次流動相時，未妥善制備新的流動相（新流動相配制不正確）。

在極少數(shù)情況下，會出現(xiàn)流動相組分選擇性損失的情況，例如蒸發(fā)。

當流動相發(fā)生變化時，峰形（色譜峰）通常會向相同的方向移動，以縮短或延長保留時間（保留時間變長或變短）；而相對保留（選擇性因子，a）通常會發(fā)生變化。

檢查流動相組成錯誤的Z佳方法是仔細檢查（復查）系統(tǒng)設置；如有必要，應制備新的流動相。

方法文件應包含特定流動相變化影響的相關信息。例如，有機溶劑或pH值的微小變化會對色譜圖產生特征（在色譜圖體現(xiàn)出特征性的）影響，如分辨率或保留的變化（分離度的變化或保留時間的漂移）。

如果您懷疑設備出現(xiàn)故障，請將色譜柱和流動相移至另一個HPLC系統(tǒng)，然后再次運行。

如果問題依然存在，則問題在于流動相或色譜柱；如果問題不再出現(xiàn)，則可能與其他系統(tǒng)組件或參數(shù)相關。

2.2.色譜柱化學（化學性質）變化會在色譜柱的整個生命周期內出現(xiàn)，并且一般會在數(shù)周或數(shù)月內逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。

更換新柱以確定是否是柱老化導致的問題（可確證色譜柱老化）。

500-2000次注射（進樣）的柱壽命是較為理想的；在這一點上，柱成本相較于整體分析，是十分微小的，所以更換新柱的可行性較高（色譜柱在整個分析的成本中所占比例低，因而可以合理更換色譜柱）。

如果色譜柱的使用壽命過短，應仔細檢查操作條件，以確保它們適用于該色譜柱。

圖5顯示了在極端操作條件下，色譜柱壽命較短的示例（縮短的壽命）。

2.3.色譜柱溫度變化會導致保留時間的變化：每1°C的溫度變化會引起1-3％的保留時間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），由于實驗室溫度的變化，溫度通常會在日間（和夜間）循環(huán)（周期性）變化。

雖然在室內恒溫器的測量下，實驗室溫度顯示為恒定，但是HPLC系統(tǒng)的微觀（微）環(huán)境可能會發(fā)生顯著變化，尤其是當供暖或空調通風口直接吹向系統(tǒng)時，溫度變化極為明顯。

使用柱溫箱可以避免色譜柱出現(xiàn)這樣的溫度問題，且HPLC系統(tǒng)應遠離通風口放置。

2.4.流量（流速）問題可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導致的。
氣泡問題應和低壓（或脈動壓力）以及保留時間的增加相關（可能伴有柱壓過低或柱壓波動，且保留時間延長）。

對于雙頭泵，如果只有一個泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會發(fā)生脈動（跳動）。

應對流動相進行脫氣，然后打開放氣閥清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流動相，以正常流速流經(jīng)泵，從而排出氣泡（打開排氣閥以正常流速的幾倍泵入5-10ml流動相經(jīng)過泵，以排出氣泡）。

在某些情況下，可能需要使用低粘度的脫氣溶劑，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）來清除泵中頑固的氣泡。

泄漏也會延長保留時間。配件（接頭）上的滴水配件或玻璃體內的結晶沉淀都是泄漏的證據(jù)（查看接頭如有液滴或結晶析出，可證明有泄露）。

請?zhí)貏e注意色譜柱上游的配件（之前的接頭）。

自動進樣器內的配件和密封件（接頭和密封圈）可能難以檢測，可借助手電筒和小鏡子進行檢查。

如果使用不銹鋼配件，通常1/4的緊固螺母（將接頭螺好再擰緊1/4圈）便可以阻止泄漏。

使用PEEK配件（接頭）時，應停止泵，松開接頭，將管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新啟動泵之前擰緊配件（接頭）。

擰緊PEEK配件（接頭）時如果存在流動的液體，會導致管道在配件中滑動，產生柱外死體積，進而影響分離效果。

存在缺陷的止回閥（單向閥）或磨損的泵密封件（圈）會導致流量偏低或波動。

止回閥（單向閥）出現(xiàn)問題將導致壓力的波動。如果在清除泵中氣泡后還無法改善壓力波動的情況，則止回閥（單向閥）可能存在故障。

可以更換新的止回閥（單向閥）；也可以將止回閥（單向閥）放置在（裝有）MeOH的燒杯中，對其進行超聲處理，以實現(xiàn)有效的清潔。

如果無法有效區(qū)分入口端和出口端之間的止回閥（如不易分清入口單向閥和出口單向閥），請劃線標記或用標簽標記燒杯。將每個止回閥（單向閥）放入單獨的燒杯中進行清潔，使其分開清潔。如果部件滑出，應小心組裝，以免受到污染（無塵手套，避免劃傷部件等）。

隨著使用時間的增加，泵密封件（圈）會出現(xiàn)磨損；而且使用緩沖流動相或將其置于高鹽條件下（例如離子交換法），會縮短它的使用壽命。

您可以建立一個預防性維護計劃，定期更換密封件并做相應記錄（準確記錄更換密封圈的時間間隔，就可以建立預防性的維護計劃），從而在故障發(fā)生前更換密封件。如果無其它指標（征兆），應至少每年更換一次密封件（圈）。

2.5.比例閥和在線混合發(fā)生故障會降低梯度洗脫的效果（使梯度洗脫效果變差）。

圖6示例顯示了兩次連續(xù)注射肽樣品的梯度洗脫分析。在這種情況下，系統(tǒng)適用性測試允許兩次運行之間存在0.1分鐘的變化（保留時間變化）；diyi個峰值不符合該標準，Z后一個峰值勉強通過而中間兩個峰值明顯超出規(guī)定值。

圖6. 兩個連續(xù)梯度運行的（兩次連續(xù)梯度洗脫）色譜圖顯示了梯度中點附近的峰形具有較大的誤差（保留時間的誤差較大）（13分鐘）。來源[3]。

下面介紹了一種檢查流動相配比（混合）精度的簡單方法。

將柱更換為0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道（取下色譜柱，換上長約1米，內徑0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，將檢測器波長設置為265nm，并使用足夠高的流速使止回閥（單向閥）能夠有效工作（例如2mL/min）。

以10％為增量運行一系列梯級（梯級實驗）（10％、20％、30％……90％、100％B）。

由于問題經(jīng)常出現(xiàn)在50％B附近，所以在45％B和55％B處增添了額外的梯級。

其結果應是平滑的階梯狀（參見圖8a）。

對于圖6的樣品，在40％-60％B的梯級中觀察到圖7的曲線。

梯級是扭曲的（已變形），且45％到50％B的梯級（梯級變化）是8.4％而不是5％。

圖7中的虛線近似于（擬合了該）梯度，同時（在）45％和50％B之間存在偏移。

因此，此處應是由具有較大保留變量的峰被洗脫導致的（不幸的是，這正是那些保留時間偏差較大的峰出峰的位置）。

HPLC系統(tǒng)可對比例閥進行調節(jié)。

當執(zhí)行此操作時，梯級會變得平滑且保留時間也會處于規(guī)格范圍之內。

圖7. 在圖6的梯度中點附近執(zhí)行配比（比例）階梯測試的結果。理論值顯示在括號內。來源[3]。

如果系統(tǒng)性能良好，其階梯測試的結果應與圖8a類似，在整個圖中呈現(xiàn)階梯狀。

未注射的0-100％B梯度是應運行的對比測試（另需同時進行一無進樣的0-B梯度試驗）。

它應顯示為線性基線、線性梯度部分和線性后期梯度保持，每個部分之間均是平滑的曲線過渡（線性梯度部分以及一段梯度升高后維持直線，每兩段之間為平滑曲線過度）。

圖9的示例顯示了在約25％、50％和75％B的線性（箭頭）條件下，空白梯度運行呈現(xiàn)有規(guī)律的偏移。

圖8. 圖9顯示了HPLC系統(tǒng)的梯度階梯測試結果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯級；（b）以1％的梯級向上跟蹤至45-55％。箭頭顯示了50和51％之間的“較短”梯級。來源[4]。

與這些條件相對應的階梯測試如圖8a所示，并且在這個度量（放大比例）下表現(xiàn)良好。

為了更仔細地檢查問題區(qū)域，在45-55％B范圍內以1％的增量進行階梯測試，如圖8b所示。

這個擴展（放大）圖清楚地顯示了在50％和51％之間的梯級中，存在不規(guī)則性。

在線性圖中的定期（有規(guī)律間隔的）誤差（圖9）表明，控制比例閥的算法或比例閥本身存在問題。

在目前的情況下，調整控制（控制軟件）軟件無法解決問題，因此應更換比例閥，以解決問題（因此更換了比例閥，問題被解決）。

圖9. 故障比例閥線性梯度圖。箭頭顯示線性偏離；繪制下面的虛線以供參考（虛線為標準參考線）。以1mL/min的速度運行梯度0-100％B 15分鐘；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；檢測UV 265nm。來源[4]。

盡管可以假設單一來源是導致特定HPLC問題的原因（雖然通?？梢约俣矵PLC問題只有一個故障原因），但情況并非總是如此。

圖10a顯示了以非常淺的梯度（30分鐘內19-24％ACN）連續(xù)三次注射肽樣品的結果（顯示了一種多肽樣品三次連續(xù)進樣，窄梯度洗脫（30分鐘內19-24%乙腈梯度洗脫））。

由于懷疑存在流量（流速）問題，因此在雙活塞雙泵系統(tǒng)中更換了所有8個止回閥（單向閥）和4個泵密封件（圈）。

這大大改善了保留變量（保留時間大為改善），保留范圍從2.1分鐘變化到1.0分鐘（圖10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。

為了進一步研究問題，將溶劑預混合到裝有15% ACN的A容器和裝有25％ACN的B容器中（在A瓶中預混合15% 乙腈，在B瓶中預混合25% 乙腈）。

當調整儀器設置以產生與圖10a和b相同的梯度時，獲得圖10c所示的結果。盡管儀器的配比精度在±0.1％的規(guī)格范圍內，但對于非常淺（窄）的梯度來說仍是不夠的。

預混合溶劑將有效精度從0.1％提高至0.01％，如果該樣品希望具有令人滿意的保留時間再現(xiàn)性，這點是必需的。

預混合可以提高系統(tǒng)性能，以滿足苛刻的分離要求。

圖10.三次連續(xù)注射肽樣品的擴充（放大）色譜圖。產生的色譜圖：（a）使用原始系統(tǒng)配置（b）更換所有止回閥（單向閥）和泵密封件（圈）后（c）使用預混流動相。色譜柱：250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃運行，并在215nm檢測。梯度：30分鐘內19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。來源[5]。

（一）顯示結果中氧氣含量高而二氧化硫和氮氧化物含量低

（1）可能原因之一：采樣管路泄漏。

處理方法：檢查樣氣取樣回路。

確認辦法：加標準氣體到煙氣分析儀的入口，觀察測量結果與標準氣體的含量是否相同。若測量值與標示值相同，則證明采樣管路泄漏。分析采樣管路泄漏需要分兩個步驟判斷是機柜內部泄漏還是機柜外部泄露。判斷方法：把樣氣閥入口斷開，用手堵死，此時分析儀面板上的浮子流量計標示應該歸零。若分析儀面板上的浮子流量計顯示零則可判斷機柜內部無問題，是機柜外部泄露，這時應檢查采樣探頭與采樣探頭的濾芯堵頭是否泄漏，找出泄漏處進行處理。

（2）可能原因之二：蠕動泵接頭松動而導致漏氣。

處理方法：重新旋緊蠕動泵接頭即可。

（二）顯示結果中氧氣和氮氧化物含量測量數(shù)據(jù)不變而二氧化硫含量低甚至為零，檢查發(fā)現(xiàn)保護過濾器內有水霧或積水

（1）冷凝器溫控器故障排查。冷凝器中的玻璃冷腔下端結冰，溫控器顯示“LLL”，關閉冷凝器電源幾小時后，再接通冷凝器電源，溫度從 10℃左右慢慢下降至-5℃，后又顯示“LLL”。對冷凝器氣體除濕的基本原理進行分析得知，冷凝器通過對蓄冷體不斷進行制冷，當過冷時又對其進行加熱，使蓄冷體恒溫在 1～7℃的某一溫度值上。插在蓄冷體中間的交換器，借助導熱介質和足夠的換熱面積迅即完成熱交換。此時，流經(jīng)交換器工作腔含水分的氣態(tài)試樣迅速冷卻，使氣體中的水分得到分離。經(jīng)分析檢測判斷為玻璃冷腔外層加熱片損壞所致，起不到加熱作用。

處理方法：更換加熱片，故障排除。

（2）蠕動泵排水故障排查。在實際工作中筆者發(fā)現(xiàn)一種疑難故障，監(jiān)測過程中二氧化硫測量值突然變小，僅為 2~3 mg／m3甚至為零，比實際值偏低很多，一段時間后恢復正常，再過一段時間測量值又變小，如此多次重復該現(xiàn)象。用標準氣體檢查，氣體分析儀示值準確，零點校準也正常，初步分析原因為樣氣有時含有水汽。首先懷疑蠕動泵泵管老化，但更換泵管后故障依舊。經(jīng)過多日蹲守現(xiàn)場進行跟蹤，觀察發(fā)現(xiàn)為冷凝器的玻璃冷腔至蠕動泵的排水系統(tǒng)異常所致。由于煙氣排放監(jiān)測設備安裝時，在冷凝器的玻璃冷腔至蠕動泵的進水端連接了較長的管路，導致玻璃冷腔排水管下垂部分較長，管路經(jīng) U型接至蠕動泵進水端，阻力較大。初安裝時，由于蠕動泵泵軸、泵管較新，U 型管的積水可以抽出；使用一段時間后，蠕動泵泵軸出現(xiàn)磨損，密封性能下降，真空度降低，因而出現(xiàn)排水有時正常、有時不正常的故障。

處理方法：對蠕動泵的排水系統(tǒng)進行改進，縮短玻璃冷腔到蠕動泵進水端連接管的長度，將玻璃冷腔的排水管直接跨接至蠕動泵的進水端。經(jīng)過一段時間的現(xiàn)場觀察，結果表明改造后效果良好。

（3）蠕動泵管及泵軸故障排查。蠕動泵管老化變形，失去彈性；蠕動泵泵軸磨損嚴重易形成堵塞，使冷凝水不能及時排出，造成出口樣氣大量帶水，影響抽吸單元和分析組件的正常運行。

處理方法：在日常維護中應定期檢查、更換蠕動泵管或泵軸。

（4）蠕動泵進出水端故障排查。蠕動泵進水端和出水端接反會造成樣氣大量帶水。

處理方法：將蠕動泵進水端與出水端對調。

（三）零點標定后二氧化硫顯示負值

故障分析：該故障表現(xiàn)為，隔一段時間二氧化硫測量值很小，僅為 2~3 mg／m3甚至為零，比實際值偏低很多，過很長時間才正常，過一段時間又重復該故障。經(jīng)過認真分析研究，發(fā)現(xiàn)是零點漂移所致。

由于儀器自動零點標定時采用空氣校準，而空氣校準對采樣空氣的濕度有特定的要求，校準空氣需用干燥空氣（儀器所附技術資料沒有說明），而南方空氣比較潮濕，特別是春天或雨季，容易導致儀器自動零點校準時零點漂移的大、小隨空氣濕度的改變而變化。

處理方法：對標定系統(tǒng)進行改進，在采樣空氣前端增加電子制冷器進行干燥處理。

（四）煙氣分析儀檢測結果誤差偏大

（1）可能原因之一：煙氣分析儀長期沒有標定，造成分析誤差越來越大。

處理方法：對煙氣分析儀進行標定。

（2）可能原因之二：所用標準氣體超過有效期。

處理方法：標準氣體的濃度是一個已知的固定值，每一種標準氣體都有有效期，超過有效期后，標準氣體的濃度發(fā)生變化，不能準確標定分析儀器。

處理方法：更換標準氣體。

（3）可能原因之三：傳感器氣室內有臟物。

處理方法：打開傳感器氣室（打開時注意裝有樣品氣體的玻璃管），使用脫脂棉、擦鏡紙、洗滌劑或合適的溶劑（例如無水乙醇）將鏡片及氣室擦干凈。要避免使用腐蝕性的清洗化合物，因為這些物料會損壞光學表面。

（五）含塵量指示不合理或數(shù)值持久不變

故障分析：含塵量測試儀鏡頭臟污。

處理方法：擦拭鏡頭并手工校準。

　　01、故障排除

　　免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，需要大量的經(jīng)驗和不斷優(yōu)化。方案中微小的變化可以顯著改變結果。如果遇到低信號、無信號或高背景，請參閱以下故障排除指南：

　　高背景：

　　02、ibidi解決方案

　　用于倒置顯微鏡的具有蓋玻片底部的ibidi μ-Slides腔室載玻片和μ-Dishes培養(yǎng)皿有多種幾何形狀可供選擇，可滿足您對免疫細胞化學的任何特定需求。所有免疫熒光染色步驟都可以直接在載玻片或培養(yǎng)皿中進行。

　　ibidi通道載玻片的幾何形狀非常適合精確交換少量的培養(yǎng)基，這在免疫細胞化學染色過程中是必要的。此外，通道μ-Slides的蓋玻片底部無需額外的蓋玻片。

　　在ibidi腔室載玻片中，帶有可移除的硅膠培養(yǎng)小室安裝在標準玻璃蓋玻片上，非常適合長時間樣品保存。

　　03、低信號或無信號