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  千千水上飄 2016-12-01 00:00:00

  找相似序列一般通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的BLAST搜索就可以了，您所提交的序列應(yīng)該為Fasta格式： >name aattccggaattccgg 關(guān)于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建： 多序列比對(duì)建議用ClustalX 建NJ或MP樹(shù)，用MEGA就可以了，非常方便 若要建ML樹(shù)推薦用phyML 建Bayes樹(shù)推薦用Parallel MrBayes @ BioHPC 如果不是專業(yè)建樹(shù)的話，MEGA足夠用了，建議參考下面這篇文章： 一、引言 開(kāi)始動(dòng)筆寫(xiě)這篇短文之前，我問(wèn)自己，為什么要寫(xiě)這樣的文章？寫(xiě)這樣的文章有實(shí)際的意義嗎？我希望能夠解決什么樣的問(wèn)題？帶著這樣的疑惑，我隨手在丁香園（DXY）上以關(guān)鍵字“進(jìn)化 分析 求助”進(jìn)行了搜索，居然有289篇相關(guān)的帖子（2006年9月12日）。而以關(guān)鍵字“進(jìn)化分析”和“進(jìn)化”為關(guān)鍵字搜索，分別找到2，733和7，724篇相關(guān)的帖子。考慮到有些帖子的內(nèi)容與分子進(jìn)化無(wú)關(guān)，這里我保守的估計(jì)，大約有 3，000~4，000篇帖子的內(nèi)容，是關(guān)于分子進(jìn)化的。粗略地歸納一下，我大致將提出的問(wèn)題分為下述的幾類： 1．涉及基本概念 例如，“分子進(jìn)化與生物進(jìn)化是不是一個(gè)概念”，“關(guān)于微衛(wèi)星進(jìn)化模型有沒(méi)有什么新的進(jìn)展”以及“關(guān)于Kruglyak的模型有沒(méi)有改進(jìn)的出現(xiàn)”，等等。 2．關(guān)于構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的方法的選擇 例如，“用boostrap NJ得到XX圖，請(qǐng)問(wèn)該怎樣理解？能否應(yīng)用于文章？用boostrap test中的ME法得到的是XXX樹(shù)，請(qǐng)問(wèn)與上個(gè)樹(shù)比，哪個(gè)更好”，等等。 3．關(guān)于軟件的選擇 例如，“想做一個(gè)進(jìn)化樹(shù)，不知道什么軟件能更好的使用且可以說(shuō)明問(wèn)題，并且有沒(méi)有說(shuō)明如何做”，“拿到了16sr RNA數(shù)據(jù)，打算做一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，可是原來(lái)沒(méi)有做過(guò)這方面的工作啊，都要什么軟件”，“請(qǐng)問(wèn)各位高手用ClustalX做出來(lái)的進(jìn)化樹(shù)與 phylip做的有什么區(qū)別”，“請(qǐng)問(wèn)有做過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析的朋友，能不能提供一下，做樹(shù)的時(shí)候參數(shù)的設(shè)置，以及代表的意思。還有各個(gè)分支等數(shù)值的意思，說(shuō)明的問(wèn)題等”，等等。 4．蛋白家族的分類問(wèn)題 例如，“搜集所有的關(guān)于一個(gè)特定domain的序列，共141條，做的進(jìn)化樹(shù)不知具體怎么分析”，等等。 5．新基因功能的推斷 例如，“根據(jù)一個(gè)新基因A氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，這個(gè)進(jìn)化樹(shù)能否說(shuō)明這個(gè)新基因A和B同源，屬于同一基因家族”，等等。 6．計(jì)算基因分化的年代 例如，“想在基因組水平比較兩個(gè)或三個(gè)比較接近物種之間的進(jìn)化年代的遠(yuǎn)近，具體推算出他們之間的分歧時(shí)間”，“如何估計(jì)病毒進(jìn)化中變異所需時(shí)間”，等等。 7．進(jìn)化樹(shù)的編輯 例如生成的進(jìn)化樹(shù)圖片，如何進(jìn)行后續(xù)的編輯，比如希望在圖片上標(biāo)注某些特定的內(nèi)容，等等。 由于相關(guān)的帖子太多，作者在這里對(duì)無(wú)法閱讀全部的相關(guān)內(nèi)容而致以歉意。同時(shí)，作者歸納的這七個(gè)問(wèn)題也并不完全代表所有的提問(wèn)。對(duì)于問(wèn)題1所涉及到的基本的概念，作者推薦讀者可參考由Masatoshi Nei與Sudhir Kumar所撰寫(xiě)的《分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育》（Molecular Evolution and Phylogenetics）一書(shū)，以及相關(guān)的分子進(jìn)化方面的Z新文獻(xiàn)。對(duì)于問(wèn)題7，作者之一lylover一般使用Powerpoint進(jìn)行編輯，而 Photoshop、Illustrator及Windows自帶的畫(huà)圖工具等都可以使用。 這里，作者在這里對(duì)問(wèn)題2-6進(jìn)行簡(jiǎn)要地解釋和討論，并希望能夠初步地解答初學(xué)者的一些疑問(wèn)。 二、方法的選擇 首先是方法的選擇。基于距離的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，Z小進(jìn)化法）和NJ（Neior-Joining，鄰接法）等。其他的幾種方法包括MP（Maximum parsimony，Z大簡(jiǎn)約法）、ML（Maximum likelihood，Z大似然法）以及貝葉斯（Bayesian）推斷等方法。其中UPGMA法已經(jīng)較少使用。 一般來(lái)講，如果模型合適，ML的效果較好。對(duì)近緣序列，有人喜歡MP，因?yàn)橛玫募僭O(shè)Z少。MP一般不用在遠(yuǎn)緣序列上，這時(shí)一般用NJ或ML。對(duì)相似度很低的序列，NJ往往出現(xiàn)Long-branch attraction（LBA，長(zhǎng)枝吸引現(xiàn)象），有時(shí)嚴(yán)重干擾進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。貝葉斯的方法則太慢。對(duì)于各種方法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)的準(zhǔn)確性，一篇綜述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005， 22(3):792-802）認(rèn)為貝葉斯的方法Z好，其次是ML，然后是MP。其實(shí)如果序列的相似性較高，各種方法都會(huì)得到不錯(cuò)的結(jié)果，模型間的差別也不大。 對(duì)于NJ和ML，是需要選擇模型的。對(duì)于各種模型之間的理論上的區(qū)別，這里不作深入的探討，可以參看Nei的書(shū)。對(duì)于蛋白質(zhì)序列以及DNA序列，兩者模型的選擇是不同的。以作者的經(jīng)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，對(duì)于蛋白質(zhì)的序列，一般選擇Poisson Correction（泊松修正）這一模型。而對(duì)于核酸序列，一般選擇Kimura 2-parameter（Kimura-2參數(shù)）模型。如果對(duì)各種模型的理解并不深入，作者并不推薦初學(xué)者使用其他復(fù)雜的模型。 Bootstrap幾乎是一個(gè)必須的選項(xiàng)。一般Bootstrap的值>70，則認(rèn)為構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)較為可靠。如果Bootstrap的值太低，則有可能進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有錯(cuò)誤，進(jìn)化樹(shù)是不可靠的。 對(duì)于進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，如果對(duì)理論的了解并不深入，作者推薦使用缺省的參數(shù)。需要選擇模型的時(shí)候（例如用NJ或者M(jìn)L建樹(shù)），對(duì)于蛋白序列使用Poisson Correction模型，對(duì)于核酸序列使用Kimura-2參數(shù)模型。另外需要做Bootstrap檢驗(yàn)，當(dāng)Bootstrap值過(guò)低時(shí)，所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能存在問(wèn)題。并且，一般推薦用兩種不同的方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如果所得到的進(jìn)化樹(shù)類似，則結(jié)果較為可靠。 三、軟件的選擇 表1中列出了一些與構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)相關(guān)的軟件。 構(gòu)建NJ樹(shù)，可以用PHYLIP（寫(xiě)得有點(diǎn)問(wèn)題，例如比較慢，并且Bootstrap檢驗(yàn)不方便）或者M(jìn)EGA。MEGA是Nei開(kāi)發(fā)的方法并設(shè)計(jì)的圖形化的軟件，使用非常方便。作者推薦MEGA軟件為初學(xué)者的shou選。雖然多雪列比對(duì)工具ClustalW/X自帶了一個(gè)NJ的建樹(shù)程序，但是該程序只有p- distance模型，而且構(gòu)建的樹(shù)不夠準(zhǔn)確，一般不用來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。 構(gòu)建MP樹(shù)，Z好的工具是PAUP，但該程序?qū)儆谏虡I(yè)軟件，并不對(duì)學(xué)術(shù)免費(fèi)。因此，作者并不建議使用PAUP。而MEGA和PHYLIP也可以用來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。這里，作者推薦使用MEGA來(lái)構(gòu)建MP樹(shù)。理由是，MEGA是圖形化的軟件，使用方便，而PHYLIP則是命令行格式的軟件，使用較為繁瑣。對(duì)于近緣序列的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，MP方法幾乎是Z好的。 構(gòu)建ML樹(shù)可以使用PHYML，速度Z快?；蛘呤褂肨ree-puzzle，速度也較快，并且該程序做蛋白質(zhì)序列的進(jìn)化樹(shù)效果比較好。而PAML則并不適合構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。ML的模型選擇是看構(gòu)出的樹(shù)的likelihood值，從參數(shù)少，簡(jiǎn)單的模型試起，到likelihood值Z大為止。ML也可以使用 PAUP或者PHYLIP來(lái)構(gòu)建。這里作者推薦的工具是BioEdit。BioEdit集成了一些PHYLIP的程序，用來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。Tree- puzzle是另外一個(gè)不錯(cuò)的選擇，不過(guò)該程序是命令行格式的，需要學(xué)習(xí)DOS命令。PHYML的不足之處是沒(méi)有win32的版本，只有適用于64位的版本，因此不推薦使用。值得注意的是，構(gòu)建ML樹(shù)，不需要事先的多序列比對(duì)，而直接使用FASTA格式的序列即可。 貝葉斯的算法以MrBayes為代表，不過(guò)速度較慢。一般的進(jìn)化樹(shù)分析中較少應(yīng)用。由于該方法需要很多背景的知識(shí)，這里不作介紹。 表1 構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)相關(guān)的軟件 軟件 網(wǎng)址 說(shuō)明 ClustalX http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/ 圖形化的多序列比對(duì)工具 ClustalW http://www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.html 命令行格式的多序列比對(duì)工具 GeneDoc http://www.psc.edu/biomed/genedoc/ 多序列比對(duì)結(jié)果的美化工具（可以導(dǎo)入fasta格式的文件，出來(lái)的圖可用于發(fā)表，我用過(guò)） BioEdit http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html 序列分析的綜合工具 MEGA http://www.megasoftware.net/ 圖形化、集成的進(jìn)化分析工具，不包括ML PAUP http://paup.csit.fsu.edu/ 商業(yè)軟件，集成的進(jìn)化分析工具 PHYLIP http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html 免費(fèi)的、集成的進(jìn)化分析工具 PHYML http://atgc.lirmm.fr/phyml/ Z快的ML建樹(shù)工具 PAML http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html ML建樹(shù)工具 Tree-puzzle http://www.tree-puzzle.de/ 較快的ML建樹(shù)工具 MrBayes http://mrbayes.csit.fsu.edu/ 基于貝葉斯方法的建樹(shù)工具 MAC5 http://www.agapow.net/software/mac5/ 基于貝葉斯方法的建樹(shù)工具 TreeView http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html 進(jìn)化樹(shù)顯示工具 （加紅色標(biāo)注的為Z通用的分析軟件） 需要注意的幾個(gè)問(wèn)題是，其一，如果對(duì)核酸序列進(jìn)行分析，并且是CDS編碼區(qū)的核酸序列，一般需要將核酸序列分別先翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行比對(duì)，然后再對(duì)應(yīng)到核酸序列上。這yi流程可以通過(guò)MEGA 3.0以后的版本實(shí)現(xiàn)。MEGA3現(xiàn)在允許兩條核苷酸，先翻成蛋白序列比對(duì)之后再倒回去，做后續(xù)計(jì)算。 其二，無(wú)論是核酸序列還是蛋白序列，一般應(yīng)當(dāng)先做成 FASTA格式。FASTA格式的序列，diyi行由符號(hào)“>”開(kāi)頭，后面跟著序列的名稱，可以自定義，例如user1，protein1等等。將所有的FASTA格式的序列存放在同一個(gè)文件中。文件的編輯可用Windows自帶的記事本工具，或者EditPlus（google搜索可得）來(lái)操作。 另外，構(gòu)建NJ或者M(jìn)P樹(shù)需要先將序列做多序列比對(duì)的處理。作者推薦使用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)的分析。多序列比對(duì)的結(jié)果有時(shí)需要后續(xù)處理并應(yīng)用于文章中，這里作者推薦使用GeneDoc工具。而構(gòu)建ML樹(shù)則不需要預(yù)先的多序列比對(duì)。 因此，作者推薦的軟件組合為：MEGA + ClustalX + GeneDoc + BioEdit。 四、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果推斷 一般碰到的幾類問(wèn)題是，（1）推斷基因/蛋白的功能；（2）基因/蛋白家族分類；（3）計(jì)算基因分化的年代。關(guān)于這方面的文獻(xiàn)非常多，這里作者僅做簡(jiǎn)要的介紹。 推斷基因/蛋白的功能，一般先用Blast工具搜索同一物種中與不同物種的同源序列，這包括直向同源物（ortholog）和旁系同源物（paralog）。如何界定這兩種同源物，網(wǎng)上有很多詳細(xì)的介紹，這里不作討論。然后得到這些同源物的序列，做成FASTA格式的文件。一般通過(guò)NJ構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并且進(jìn)行Bootstrap分析所得到的結(jié)果已足夠。如果序列近緣，可以再使用MP構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行比較。如果序列較遠(yuǎn)源，則可以做ML樹(shù)比較。使用兩種方法得到的樹(shù)，如果差別不大，并且Bootstrap總體較高，則得到的進(jìn)化樹(shù)較為可靠。 基因/蛋白家族分類。這方面可以細(xì)分為兩個(gè)問(wèn)題。一是對(duì)一個(gè)大的家族進(jìn)行分類，另一個(gè)就是將特定的一個(gè)或多個(gè)基因/蛋白定位到已知的大的家族上，看看屬于哪個(gè)亞家族。例如，對(duì)驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）超家族進(jìn)行分類，屬于diyi個(gè)問(wèn)題。而假如得到一個(gè)新的驅(qū)動(dòng)蛋白的序列，想分析該序列究竟屬于驅(qū)動(dòng)蛋白超家族的14個(gè)亞家族中的哪一個(gè)，則屬于后一個(gè)問(wèn)題。這里，一般不推薦使用MP的方法。大多數(shù)的基因/蛋白家族起源較早，序列分化程度較大，相互之間較為遠(yuǎn)源。這里一般使用NJ、ME或者M(jìn)L的方法。 計(jì)算基因分化的年代。這個(gè)一般需要知道物種的核苷酸替代率。常見(jiàn)物種的核苷酸替代率需要查找相關(guān)的文獻(xiàn)。這里不作過(guò)多的介紹。一般對(duì)于這樣的問(wèn)題，序列多數(shù)是近緣的，選擇NJ或者M(jìn)P即可。 如果使用MEGA進(jìn)行分析，選項(xiàng)中有一項(xiàng)是“Gaps/Missing Data”，一般選擇“Pairwise Deletion”。其他多數(shù)的選項(xiàng)保持缺省的參數(shù)。 五、總結(jié) 在實(shí)用中，只要方法、模型合理，建出的樹(shù)都有意義，可以任意選擇自己認(rèn)為好一個(gè)。Z重要的問(wèn)題是：你需要解決什么樣的問(wèn)題？如果分析的結(jié)果能夠解決你現(xiàn)有的問(wèn)題，那么，這樣的分析足夠了。因此，在做進(jìn)化分析前，可能需要很好的考慮一下自己的問(wèn)題所在，這樣所作的分析才有針對(duì)性。 六、致謝 本文由mediocrebeing在2005年9月8日所發(fā)起的討論《關(guān)于建樹(shù)的經(jīng)驗(yàn)》擴(kuò)充、修改而來(lái)。文章的作者按原貼ID出現(xiàn)先后排名，由 lylover執(zhí)筆。作者同時(shí)感謝所有參與討論的戰(zhàn)友。作者lylover感謝ZG科大細(xì)胞動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室的金長(zhǎng)江博士所給的一些有益的建議。 來(lái)源:丁香園(mediocrebeing， rodger， lylover ， klaus， oldfish， yzwpf)

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