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  jinjijinn 2017-04-09 00:00:00

  血液基因組DNA提取前為什么要先進行紅細胞裂解 全血基因組DNA提取試劑盒作用原理： 全血基因組DNA提取試劑盒特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng)，提取全血基因組DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為新型材料，能夠GX、專一吸附DNA，可Z大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。 全血基因組DNA提取試劑盒使用說明： 使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。 樣品的處理(本產(chǎn)品適用于處理新鮮的或已經(jīng)添加抗凝劑的0.lmL-1mL血液樣品)： a、在血液樣品中加入2-3倍體積的紅細胞裂解液，充分顛倒混勻，12000rpm離心1min，小心吸去上清，沉淀應(yīng)為白色或淡紅色，如果裂解不徹底，可重復(fù)以上述步驟一次。向沉淀中加200μL溶液YA，振蕩至徹底混勻。 b、 如果處理的血樣為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的血液，其紅細胞為有核細胞，因此處理量為5-20μL，不需要再用紅細胞裂解液處理，直接加200μL溶液YA，振蕩至徹底混勻。 向懸浮液中加入20μL 的RNase A (10mg/mL)，充分顛倒混勻，室溫放置10min。 加入20μL的蛋白酶K( 10mg /mL )，充分顛倒混勻，65℃水浴消化30-60min，消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直至樣品消化完全為止。 加入200μL溶液YB，再加入200μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，室溫放置2min。 12000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜ZY懸空滴加50-200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min。 離心所得洗脫液可再加入吸附柱中，12000rpm離心2min，即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。 全血基因組DNA提取試劑盒注意事項: 本試劑盒置于室溫( 15 -25℃) 干燥條件下可保存12個月，更長時間的保存可置于2 -8℃。 常用的血液抗凝劑有EDTA、ACD和肝素等，需注意的是，如欲制備大分子量血液基因組DNA，可優(yōu)先考慮使用ACD抗凝。一般不使用肝素抗凝，因為用肝素抗凝的血液提取的基因組DNA進行PCR擴增時，有PCR擴增YZ現(xiàn)象。 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會導(dǎo)致提取的DNA片段較小且提取量也下降。 4、如果試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響效果。 絕大多數(shù)哺乳動物全血中的紅細胞無核，故在提取基因組DNA時需去除不含DNA的無核紅細胞，以免影響白細胞裂解和DNA釋放。如果處理的血樣為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的血液，其紅細胞為有核細胞，因此處理量減少為5-20μL，不需要再用紅細胞裂解液來裂解紅細胞。 洗脫緩沖液的體積Z好不少于50μL，體積過小會影響回收效率:洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響；若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH 值低于7.0會降低洗脫效率。

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