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  幻雪夜57 2016-12-01 23:38:49

  以下都是思路，具體的反應(yīng)和實驗細節(jié)，假如思路清楚后，隨便找一本實驗書就可以明白。這兩種方法，思路上很簡單，很多教科書，特別是實驗書上都有圖可參考。因為不懂，所以更要多看多翻多想。 【下面的回答，有謬誤，請大家指正和完善】 ------------------------------------------------------------------- 加-減法（plus-minus sequencing）: Sanger于1975年發(fā)明，使人們有可能diyi次“讀”出DNA的堿基序列。 首先，在做“加法體系”和“減法體系”以前的工作。 待測DNA的單鏈作為模板，一個合適的引物，四種dNTP，用同位素標記。 DNA聚合酶從引物開始合成一條互補鏈，理想情況是，合成所產(chǎn)生各種長度的片段都存在。 然后除去那些未參與合成的dNTP，將剩下的合成產(chǎn)物，分成兩部分。 一部分用于加法系統(tǒng)，一部分用于減法系統(tǒng)。 加法系統(tǒng)：將用于加法系統(tǒng)的產(chǎn)物再分成四小份，每一小份中僅僅將四份中的dNTP的一種加入反應(yīng)體系。比如僅加入dATP。由于DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反應(yīng)體系中缺少另外三種必要的dNTP，合成產(chǎn)物就從3′→5′方向降解。然而由于存在dATP，顯然遇到dA的位置降解反應(yīng)就停止了。因而所有的片段都是以A結(jié)尾的。同理，可以分別制備以C、G或T結(jié)尾的另外三組片段。 四組片段在同一塊凝膠板的不同樣品槽中同時電泳（這類圖LZ可以在書上隨便找到），從放射自顯圖上就可以推斷出堿基序列，因為從A樣品槽查出的放射性區(qū)帶代表A在片段中的位置，同理也可定出C、G和T的位置。 【加法系統(tǒng)實際就是以降解為條件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性為基礎(chǔ)，當降解過程遇到試劑中所富含的dNTP時，反應(yīng)就停止】 按理只用一個加法系統(tǒng)就足以推斷DNA的堿基序列了。但由于技術(shù)上的原因，只用一種方法有時不能得到完全正確的結(jié)果，因此又設(shè)計了一種減法系統(tǒng)。 減法系統(tǒng)：也是將上述酶促產(chǎn)物分成四小份，每一小份中只加入三種dNTP，比如缺少dATP。在這個反應(yīng)體系中，DNA聚合酶能夠把片段繼續(xù)合成下去，但是在遇到應(yīng)該是dATP參入的位置時，合成反應(yīng)就停下來了。這就可以得到一個都是以A前一個位置為結(jié)尾的片段組，電泳后同樣可以定出A的位置。 【減法系統(tǒng)實際就是以合成為條件，當合成過程缺少需要的dNTP時，反應(yīng)就停止】 但此加減法并不盡如人意，由于反應(yīng)速度上的差異，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有時可能導致漏讀和重讀，有時圖譜上還會出現(xiàn)假譜線，當同樣堿基排列時圖譜上有時只出現(xiàn)一條帶。因此用這個方法測定DNA片段可能有1/50的誤差。目前常用的是它的改進法-雙脫氧末端終止法。 剩下的就是讀板的問題，可以想到，在理想情況下，比如以A結(jié)尾的各種長度的片段，出現(xiàn)的可能性是均等的。那么在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，相對分子量小的片段遷移速度快。書上的圖，都是一塊板子，有四個列，分別是以四種不同結(jié)尾的核苷酸的電泳情況。跑在越前面的（也就是Z靠近底部的），就diyi個被讀出來，隨后的相對分子量不斷增大，遷移速度慢，也就是比較大的片段，按其順序和所處的列，就克直觀讀出序列。 --------------------------------------------------------------------- 【化學法（chemical method）】由Maxam-Gilbert在1977年發(fā)明。 一、取待測DNA片段，既可以是單鏈也可以是雙鏈。 此法又叫化學切割法，或化學降解法，切割之前先對待測片段作末端標記。用放射性P32-磷酸集團標記鏈的末端之一。 二、將標記完的樣品，分成四份。分別采用不同的化學試劑對所得樣品，進行修飾進而切割【切割就是利用特異的化學試劑，修飾DNA分子中不同的堿基，使被修飾的堿基之間的連接變得不穩(wěn)定，發(fā)生斷裂，而產(chǎn)生各種長度的DNA片段?！?【四組切割的方法，在G、G+A、T+C、C處切割】 “+”就是同時切割，有點討厭的是這點，能修飾A，使其糖苷鍵不穩(wěn)定的甲酸，同時也會使G的不穩(wěn)定，所以無奈就有了G+A并在一起， （1）G反應(yīng)，"硫酸二甲酯"，使鳥嘌呤G的N7原子甲基化，而與脫氧戊糖之間的糖苷鍵不穩(wěn)定，可在中性環(huán)境中受熱斷裂，得到一系列G末端的片段。 （2）G+A反應(yīng) "甲酸"，使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，糖苷鍵變得不穩(wěn)定，可用哌啶將其斷裂，得到一系列A和G混合的末端的片段。 （3）T+C反應(yīng) "肼"，使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，通過消除反應(yīng)，使DNA鏈發(fā)生斷裂，得到一系列T+C末端的片段。 （4）C反應(yīng) 在NaCl存在時，只有C與肼反應(yīng)，得到一系列C末端的片段。 用上面加減法一樣的電泳，克得到結(jié)果，直觀讀出。 至于為什么（2）（3）兩步，為什么是G+A、T+C？ 事實上，如果有單獨只斷A的或只斷T的修飾方法，也可以。但從書上列出的圖中，可以看出，斷裂的混合物G+A、T+C電泳后并不影響讀結(jié)果。 ---------------------------------------------------------------------

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