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  嘆雪落無聲 2016-12-26 00:00:00

  中性粒細胞(PMN)是機體防御系統(tǒng)的主要組成部分，能吞噬和殺滅多種致病原。致病原與血清中的特異性抗體(IgG)結(jié)合后，通過IgG的Fc部分與PMN表面的受體——FcγRⅢ(CD16b)相結(jié)合，從而被吞噬。FcγRⅢ有a、b兩種類型，F(xiàn)cγRⅢa(CD16a)是一種跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一種糖肌醇磷脂蛋白(GPI-錨蛋白)［1］。近年發(fā)現(xiàn)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)患者在血細胞表面缺失各種特異的GPI-錨蛋白，CD16b正是這類蛋白之一。為探討PMN表面CD16b的缺失與PMN釋放氧自由基殺菌功能的關(guān)系，將我們的研究報告如下。 材料和方法 1　標本采集　正常人外周血取自協(xié)和醫(yī)院血庫正常獻血者，正常取自協(xié)和醫(yī)院胸外科手術(shù)患者的肋骨，PNH患者按1987年全國溶血性貧血會議擬定的診斷標準，并經(jīng)流式細胞儀免疫熒光法檢測CD59標記率進一步確診。 2　中性粒細胞的分離　 新鮮的外周血或，用肝素抗凝，經(jīng)淋巴細胞分離液分離，去除淋巴細胞和單個核細胞，用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11 萬) 沉降和低滲法去除紅細胞，得到純凈的中性粒細胞。用臺盼藍染色法檢查細胞活力，須保證細胞存活率大于95%。 3　間接免疫熒光法檢測CD16　取1×106個細胞，懸浮于100μl 2% BSA中，室溫封閉30分鐘，加 CD16單克隆抗體(Immunotech SA公司產(chǎn)品)，在室溫作用30分鐘后，用PBS洗滌2次，再懸浮于100μl 2％BSA中，加FITC 標記的羊抗鼠IgG(Gibco公司產(chǎn)品)室溫暗染20分鐘后洗去二抗。用500μl PBS懸浮細胞，用流式細胞儀檢測CD16 標記率。 4　中性粒細胞功能測定　 佛波醇酯(PMA，Sigma產(chǎn)品，用DMSO溶解，配制成1mg/ml，儲存于－20℃，臨用前稀釋)能激活中性粒細胞，使之釋放活性氧，其中O-2*和H2O2能與化學發(fā)光劑Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工廠)反應(yīng)而發(fā)光。用LKB-1250發(fā)光儀(Luminometer)檢測。正常人和PNH患者中性粒細胞，制備成細胞懸液(107 /ml)與 100nmol/L PMA 反應(yīng)，37℃15分鐘，置于冰上終止反應(yīng)，取含1×105 細胞的激活液加入到1ml 0.1nmol/L 的Luminol 溶液中，立即測定發(fā)光值，每一數(shù)值測定3次以上， 取平均值。取正常人的不同細胞數(shù)，測定發(fā)光值，結(jié)果顯示發(fā)光值與細胞數(shù)有良好的線性關(guān)系，說明此方法具有可靠性 (附圖)。 附圖　細胞數(shù)與發(fā)光值的線性關(guān)系 5　細胞培養(yǎng)　以 1×106個細胞/ml的密度接種PMN于IMDM培養(yǎng)基(含10%自身血清)，37℃、5% CO2分別培養(yǎng)12，16，20小時。 6　細胞形態(tài)學觀察　不同培養(yǎng)時間的細胞用瑞氏染色，光學顯微鏡下觀察。 7　DNA含量分析　取細胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇(4℃)固定12小時以上，用PBS洗去乙醇，加入0.5ml檸檬酸-磷酸緩沖液(pH 7.8)室溫作用5分鐘，離心后以PBS重懸細胞，加入 RNaseA (終濃度60μg/ml)37℃作用30分鐘，再加入碘化乙錠(PI，終濃度50μg/ml)4℃暗染30分鐘，以染細胞內(nèi)總DNA，用流式細胞儀分析正常細胞和凋亡細胞，計算凋亡率。 結(jié)　　果 1　形態(tài)學觀察　新鮮外周血分離出的中性粒細胞有典型的分葉核，經(jīng)培養(yǎng)后，形態(tài)出現(xiàn)一系列凋亡細胞特性的形態(tài)學改變。培養(yǎng)12小時，細胞體積變小，胞漿濃縮，核濃縮；培養(yǎng)16小時以后，部分細胞聚集成團，細胞核碎裂成小塊，胞漿中出現(xiàn)空泡，凋亡小體形成。培養(yǎng)時間越長，光鏡下可見的凋亡細胞比率越高。 2　中性粒細胞培養(yǎng)過程中CD16的標記率隨時間的延長逐漸降低，而凋亡率逐漸增加，中性粒細胞的功能則呈明顯的下降趨勢，結(jié)果見表1。 表1　體外培養(yǎng)不同時間的正常外周血中性粒細胞的幾項指標比較 培養(yǎng)時間 (小時) CD16標率 (%) 流式儀檢測 凋亡率(%) 發(fā)光頻率 (次/分) 0 99.5 1.2 124.32 12 64.4 29.5 67.27 16 30.0 39.4 45.43 20 18.1 64.0 30.18 3　PNH患者的PMN釋放超氧功能與正常人相比有顯著的差異，結(jié)果見表2。 表2　PNH患者與正常中性粒細胞幾項指標的比較 組別 例 數(shù) CD59標記率 (%) CD16標記率 (%) 發(fā)光頻率 (次/分) 正常組 10 ＞95.00 ＞95.00 117.16±11.47 PNH組 5 13.60±4.26 2.44±0.98 44.82±16.52 P值 　 ＜0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 討　　 論 　　Ravetch等［1］報告CD16有變異型分布在不同細胞。CD16a分布在巨噬細胞和NK細胞表面，是跨膜蛋白；CD16b僅存于PMN，是GPI錨蛋白。我們應(yīng)用CD16單抗檢測CD16b在PMN表面的量。 　　PMN的殺菌功能涉及許多方面，有氧化型和非氧化型因素。本實驗用不依賴于Fc受體的激活劑PMA來激活PMN，應(yīng)用發(fā)光法測定氧自由基，包括O-2*、H2O2及OH-，測定時，加入PMN激活液即刻連續(xù)記錄1分鐘，以發(fā)光Z高值計算，代表PMN受刺激后的即刻反應(yīng)，反映釋放氧自由基的能力，氧化型殺菌的功能。 　　PNH是造血干細胞PIG-A基因突變引起的克隆病，不同患者的異常血細胞GPI-錨蛋白缺失情況有很大差異，Schubert等［2］報道，PNH患者CD16缺失較CD59更明顯，我們也觀察到這個現(xiàn)象(結(jié)果見表2)，而且發(fā)現(xiàn)中PMN CD16b陰性細胞比外周血多，因此選擇了PNH患者的PMN作為研究對象，并且我們所選擇的都是病情較嚴重，病態(tài)細胞率高的病例(以CD59的標記率為標準)，因此結(jié)果更具有可靠性。 　　從以上結(jié)果得知CD16b表達量低的PNH患者，PMN釋放氧的能力亦低，兩者有平行的關(guān)系。為了進一步證實它們的相關(guān)性，應(yīng)用正常人PMN在體外培養(yǎng)，也獲得同樣的結(jié)果。在培養(yǎng)過程中CD16b逐漸減少，釋放氧自由基的功能也降低，兩者有相伴關(guān)系。Hunizinga等［3］也曾發(fā)現(xiàn)在PMN激活的同時有CD16b的丟失。 　　根據(jù)Dransfield等［4］的報道，隨CD16b表達量的下降，PMN逐漸凋亡。所以在PMN體外培養(yǎng)的同時又觀察了其凋亡的情況。從形態(tài)及DNA含量變化，證實在CD16b表達量降低，釋放氧自由基功能降低的同時，細胞出現(xiàn)凋亡，凋亡程度與其兩項指標降低程度同步。 　　總之，正常人PMN在凋亡過程中CD16b減少的同時，釋放氧自由基的功能也降低；PNH患者CD16b減少，釋放氧自由基也減少，至于兩者之間有何內(nèi)在關(guān)聯(lián)，有待進一步研究。但至少從另一個側(cè)面說明PNH患者PMN表面CD16b缺失，使受體介導(dǎo)的特異性識別吞噬病原菌的功能下降；釋放活性氧減少以致氧化殺菌功能降低，這兩方面可能是PNH患者易受感染的原因。 參 考 文 獻 1　Ravetch，JV，Perussia B.Alternative membrane forms of FcγRⅢ (CD16)on human natural killer cells and neutrophils.J Exp Med，1989，170:481-497. 2　Schubert J，Alvarado M，Ucicechowski P，et al.Diagnosis of PNH using immunophenotyping of peripheral blood cells.Br J Haematol，1991，79:487-492. 3　Hunizinga TWJ， van der Schoot CE，Jost C，et al.The PI-linked FcγRⅢ is released on stimulation of neutrophils.Nature，1988，333:667-669. 4　Dransfield I，Buckle AM，Savill JS，et al.Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD16(FcγRⅢ) expression.J Immunol，1994，152:1254-1263

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