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  guodongjia 2016-12-31 00:00:00

  中性粒細胞(PMN)是機體防御系統(tǒng)的主要組成部分，能吞噬和殺滅多種致病原。致病原與血清中的特異性抗體(IgG)結(jié)合后，通過IgG的Fc部分與PMN表面的受體——FcγRⅢ(CD16b)相結(jié)合，從而被吞噬。FcγRⅢ有a、b兩種類型，F(xiàn)cγRⅢa(CD16a)是一種跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一種糖肌醇磷脂蛋白(GPI-錨蛋白)［1］。近年發(fā)現(xiàn)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)患者在血細胞表面缺失各種特異的GPI-錨蛋白，CD16b正是這類蛋白之一。為探討PMN表面CD16b的缺失與PMN釋放氧自由基殺菌功能的關(guān)系，將我們的研究報告如下。 材料和方法 1　標本采集　正常人外周血取自協(xié)和醫(yī)院血庫正常獻血者，正常取自協(xié)和醫(yī)院胸外科手術(shù)患者的肋骨，PNH患者按1987年全國溶血性貧血會議擬定的診斷標準，并經(jīng)流式細胞儀免疫熒光法檢測CD59標記率進一步確診。 2　中性粒細胞的分離　 新鮮的外周血或，用肝素抗凝，經(jīng)淋巴細胞分離液分離，去除淋巴細胞和單個核細胞，用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11 萬) 沉降和低滲法去除紅細胞，得到純凈的中性粒細胞。用臺盼藍染色法檢查細胞活力，須保證細胞存活率大于95%。 3　間接免疫熒光法檢測CD16　取1×106個細胞，懸浮于100μl 2% BSA中，室溫封閉30分鐘，加 CD16單克隆抗體(Immunotech SA公司產(chǎn)品)，在室溫作用30分鐘后，用PBS洗滌2次，再懸浮于100μl 2％BSA中，加FITC 標記的羊抗鼠IgG(Gibco公司產(chǎn)品)室溫暗染20分鐘后洗去二抗。用500μl PBS懸浮細胞，用流式細胞儀檢測CD16 標記率。 4　中性粒細胞功能測定　 佛波醇酯(PMA，Sigma產(chǎn)品，用DMSO溶解，配制成1mg/ml，儲存于－20℃，臨用前稀釋)能激活中性粒細胞，使之釋放活性氧，其中O-2*和H2O2能與化學(xué)發(fā)光劑Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工廠)反應(yīng)而發(fā)光。用LKB-1250發(fā)光儀(Luminometer)檢測。正常人和PNH患者中性粒細胞，制備成細胞懸液(107 /ml)與 100nmol/L PMA 反應(yīng)，37℃15分鐘，置于冰上終止反應(yīng)，取含1×105 細胞的激活液加入到1ml 0.1nmol/L 的Luminol 溶液中，立即測定發(fā)光值，每一數(shù)值測定3次以上， 取平均值。取正常人的不同細胞數(shù)，測定發(fā)光值，結(jié)果顯示發(fā)光值與細胞數(shù)有良好的線性關(guān)系，說明此方法具有可靠性 (附圖)。 附圖　細胞數(shù)與發(fā)光值的線性關(guān)系 5　細胞培養(yǎng)　以 1×106個細胞/ml的密度接種PMN于IMDM培養(yǎng)基(含10%自身血清)，37℃、5% CO2分別培養(yǎng)12，16，20小時。 6　細胞形態(tài)學(xué)觀察　不同培養(yǎng)時間的細胞用瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。 7　DNA含量分析　取細胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇(4℃)固定12小時以上，用PBS洗去乙醇，加入0.5ml檸檬酸-磷酸緩沖液(pH 7.8)室溫作用5分鐘，離心后以PBS重懸細胞，加入 RNaseA (終濃度60μg/ml)37℃作用30分鐘，再加入碘化乙錠(PI，終濃度50μg/ml)4℃暗染30分鐘，以染細胞內(nèi)總DNA，用流式細胞儀分析正常細胞和凋亡細胞，計算凋亡率。

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