Binding of the HSF?1 DNA?binding domain to multimeric C. elegans consensus HSEs is guided by cooperative interactions

HSF?1 DNA與C. elegans HSEs的結(jié)合作用研究

發(fā)表日期：28 May 2022

DOI：https://doi.org/10.1038/s41598-022-12736-x

摘要：

熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)是熱休克反應(yīng)(HSR)的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，它激活HSR基因，如Hsp70，HSPs和HSP40s，并與熱休克要素(HSEs)結(jié)合誘導(dǎo)保守?zé)嵝菘说鞍咨险{(diào)。除了這些眾所周知的HSPs之外，在線蟲基因的啟動子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了4000多個其他HSPs。線蟲的HSF-1是一種含有671個氨基酸的蛋白質(zhì)，像其他HSF蛋白一樣，HSF-1由 N端DNA結(jié)合域(DBD)，寡聚結(jié)構(gòu)域和羧基端調(diào)控結(jié)構(gòu)域組成。本文的目的是了解HSF-1如何與不同啟動子相互作用，為此，作者純化了線蟲HSF-1 DBD，研究其與來自線蟲基因組的不同調(diào)控HSEs的相互作用。

目的：使用沉降速率法分析型超速離心技術(shù)(SV-AUC)來確定HSF-1 DBD與HSEs結(jié)合的化學(xué)計量比、親和性。

儀器型號：ProteomeLab XL-A

實驗數(shù)據(jù)：

圖1: 通過SV-AUC分析特定啟動子與Hsf-1 DBD的相互作用。HSF-1 DBD以0 - 15倍的過量濃度滴定到每個啟動子中。向右的移動表示HSF-1 DBD與DNA結(jié)合。左圖為260 nm處測量的吸光度的Dc /dt， 右圖為280 nm。使用的啟動子分別為:(a) HSP-70;(b) HSP16.2a;(c) HSP16.2 b;(d) HSP-1;(e) DNJ-13;(f) UNC-23;(g) DNJ-12。

表1：用于自定義網(wǎng)格擬合方法的參數(shù)。在這個模型中，HSE被嵌入到相同尺寸的探針中，S為沉降系數(shù)。

表2：通過SV-AUC擬合計算KD值。沒有顏色=結(jié)合，橙色=弱結(jié)合，紅色=無結(jié)合。

實驗結(jié)果：

在線蟲基因組中有4120個SHE，它們在起始密碼子上游500 bp處含有HSF-1結(jié)合區(qū)。令人驚訝的是，盡管有許多HSF-1調(diào)控基因，但典型的熱休克反應(yīng)僅對應(yīng)8個基因，其中7個由HSF-1結(jié)合啟動子區(qū)域調(diào)控。因此，HSF-1的作用所產(chǎn)生的調(diào)控程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了脅迫條件下應(yīng)激基因的誘導(dǎo)，在非脅迫條件下可以達(dá)到線蟲的正常生長周期。在較大的生物體中，這種方法能夠?qū)⒉煌呐上颠B接到不同的組織和發(fā)育狀態(tài)。

AUC實驗條件：未說明

REFERENCE

Schmauder, L., Sima, S., Hadj, A.B., Cesar, R. and Richter, K., 2022. Binding of the HSF-1 DNA-binding domain to multimeric C. elegans consensus HSEs is guided by cooperative interactions. Scientific Reports, 12(1), pp.1-19.

Atomic Structures of Coxsackievirus B5 Provide Key Information on Viral Evolution and Survival

柯薩奇病毒B5原子分辨率結(jié)構(gòu)提供有關(guān)病毒進化和生存的關(guān)鍵信息

發(fā)表日期：20 April 2022

DOI:  https://doi.org/10.1128/jvi.00105-22

摘要：

柯薩奇病毒B5 (CVB5) 是人類腸道病毒B (EVB) 的主要血清型，可引起嬰兒和兒童的嚴(yán)重病毒性腦炎和無菌性腦膜炎。目前，尚無針對CVB5感染的獲批疫苗或抗病毒療法。在這里，我們確定了三種形式的CVB5原子分辨率結(jié)構(gòu)：成熟 (F) 粒子 (2.73 ?)（Full）、中間(A) 粒子 (2.81 ?)( intermediate) 和空衣殼(E)粒子 (2.95 ?) （empty）。CVB5的 F 粒子的結(jié)構(gòu)分析揭示了與其他 EV-B 相似的“canyon” “puff” 和“knob” 結(jié)構(gòu)。我們觀察到在從 F 粒子到 A 粒子的轉(zhuǎn)變過程中存在相似的結(jié)構(gòu)重排，表明所有 EV-B 共有相似抗原性、細(xì)胞進入和脫殼機制。進一步比較所有已知EV-B結(jié)構(gòu)和序列表明，雖然中和抗體靶向的殘基是多樣化的且推動了EV-B的進化，但脫殼受體識別的相對保守的殘基可以作為開發(fā)抗病毒疫苗的基礎(chǔ)和療法。

IMPORTANCE：

CVB5作為腸道病毒B的主要血清型之一，近年來被廣泛報道。此處顯示的 CVB5 原子分辨率結(jié)構(gòu)揭示了 EV-B 中發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典特征以及粒子膨脹和脫殼過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)重排。此外，CVB5與其他結(jié)構(gòu)已知的EV-B之間基于結(jié)構(gòu)和序列的比較篩選出對病毒進化和存活重要的關(guān)鍵域。所有這些都為 EV-B 的疫苗和治 療方法的開發(fā)提供了見解。

儀器型號：Beckman XL-I 分析超速離心機、貝克曼制備型超速離心機

CVB5純化和結(jié)構(gòu)測定

(a) 用于 CVB5 純化的蔗糖密度梯度濃度 (15%-45%)，如材料和方法中所述。觀察到兩條明顯的條帶，上條帶A260/A280吸收比為0.65，主要含E粒子，下條帶吸收比為1.83，主要含F(xiàn)粒子。(b) 分析超速離心 (AUC)。該樣品產(chǎn)生了兩個主要的峰，沉降系數(shù)分別為 80 S和143 S。

AUC實驗條件：

1. 在 20°C 條件下，在Beckman XL-I 分析超速離心機上進行沉降速率實驗。

2. 制備的高濃度樣品用 PBS 緩沖液 (pH 7.4) 稀釋至400 微升，在A280 nm處吸收約為 0.7，并進一步加樣至到雙扇形石英樣品池中，然后放置于Beckman四孔 An-60Ti 轉(zhuǎn)子中。

3. 在 280 nm波長下以 8064 xg收集數(shù)據(jù)。最 后使用SEDFIT軟件擬合干涉數(shù)據(jù) 。

REFERENCE

Yang P, Shi D, Fu J, Zhang L, Chen R, Zheng B, Wang X, Xu S, Zhu L, Wang K. Atomic Structures of Coxsackievirus B5 Provide Key Information on Viral Evolution and Survival. J Virol. 2022 May 11;96(9):e0010522. doi: 10.1128/jvi.00105-22. Epub 2022 Apr 20. Erratum in: J Virol. 2022 Nov 23;96(22):e0157322.

Nonclassical Recrystallization

非典型晶體結(jié)晶

發(fā)表日期：22 June 2020

DOI:doi.org/10.1002/chem.202002873

摘要：

在材料科學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域，對單分散系統(tǒng)中的納米顆粒的大小和形狀表征需求越來越多。到目前為止，沒有非常有效的方式可以依據(jù)納米顆粒的大小和形狀進行純化。這里，我們使用一種絕 對定量的高分辨率方法——分析型超速離心機(AUC)，是一個非常有效的從納米晶體到介觀晶體來生成納米晶體的方式，達(dá)到了迄今為止無人能及尺寸分布(PDIc=1.0001)和形狀。類似于分子積木的結(jié)晶，非經(jīng)典的再結(jié)晶去除了“膠體”雜質(zhì)(即納米顆粒，它們在形狀和大小上與大多數(shù)不同)，將它們組裝成一個介觀晶體。在這種情況下，由于介觀晶體既顯示了遠(yuǎn)距離排列順序以及較好的納米晶體取向，納米晶體可以大小和形狀選擇性進行組裝。除了產(chǎn)生高度單分散的納米顆粒，這些發(fā)現(xiàn)提供了介觀晶體的結(jié)晶新思路。

目的：用于表征納米晶體及其相應(yīng)的介觀晶體的摩擦系數(shù)比和沉積系數(shù)分布。

儀器型號：Optima XL I

環(huán)己烷納米晶體及其相應(yīng)的介觀晶體。a-d)從環(huán)己烷中分離純化出不同批次的納米顆粒沉積系數(shù)分布。批次II-IV含有大部分較大的“膠體”雜質(zhì)，而批次V含有較小的 “膠體”雜質(zhì)。所有不同的納米晶批次均可獲得介觀晶體。高度純化后得到單分散納米晶體。非擴散修正g(s)包含高分辨率擴散修正c (s)

實驗條件：未說明

REFERENCE

E. Brookes, W. Cao, B. Demeler, Eur. Biophys. J. 2010, 39, 405; b) B. Demeler, UltraScan version 4.0, release 2783. A Comprehensive Data Analysis Software Package for Analytical Ultracentrifugation Experiments. The University of Lethbridge, Department of Chemistry and Biochemistry.http://www.ultrascan3.aucsolutions.com/download.php

Cyclization studies of Japanese encephalitis virus non-coding RNA terminal regions

乙型腦炎病毒非編碼RNA末端區(qū)域的環(huán)化研究

發(fā)表日期：February 2, 2022

DOI：https://doi.org/10.1101/2022.02.01.478553

摘要：許多黃病毒如登革熱病毒和西尼羅河病毒在其 5' 和 3' 末端區(qū)域 (TRs) 進行必要的遠(yuǎn)程相互作用，由保守的互補環(huán)化序列介導(dǎo)。然而，我們?nèi)狈θ毡灸X炎病毒 (JEV) 的這種遠(yuǎn)程相互作用的深入了解。在這里，我們使用了涉及計算和生物物理工具的廣泛、多方面的方法。我們進行了多角度光散射 (SEC-MALS) 來確定 JEV TR 的絕 對分子量，它們的復(fù)合物得出結(jié)論它們形成 1:1 復(fù)合物，并使用分析超速離心 (AUC) 證實了這種相互作用。微型熱泳 (MST) 實驗表明，JEV 的 5' 和 3' TR 與 nM 親和力相互作用，在沒有保守環(huán)化序列的情況下顯著降低。據(jù)我們所知，這是第 一項代表應(yīng)用三種關(guān)鍵生物物理方法（AUC、MST 和 SEC-MALS）研究 RNA-RNA 相互作用的研究。此外，我們進行了計算動力學(xué)分析，證實了我們的 MST 研究表明環(huán)化序列在 RNA-RNA 相互作用中的重要作用。這種生物學(xué)關(guān)鍵事件的結(jié)合親和力是一個重要的藥理學(xué)特征，可以影響治 療的潛在競爭性抑 制。這一證據(jù)還可以影響旨在抑 制保守黃病毒環(huán)化的藥物干預(yù)，從而中斷黃病毒家族的復(fù)制。

儀器型號：Optima AUC  紫外(UV)檢測系統(tǒng)

從沉降速率-分析超速離心獲得的 JEV 5' TR 和 3'TR 的沉降分布圖

實驗條件：

1. JEV 5' TR 和 3' TR 的 AUC 沉降速度數(shù)據(jù)是使用 Beckman Optima AUC 離心機和 AN50-Ti 轉(zhuǎn)子在 20°C 下收集的。

2.  將 JEV 5'TR（214 nM，0.5 OD @260 nm）、JEV 3'TR（224 nM，0.5 OD @260 nm）和 JEV 5'TR 和 3'TR 樣品的 1:1 混合物加載到 2 通道Epon樹脂中心件。

3. 以每分鐘 25,000 轉(zhuǎn)的速度離心樣本，并以 20 秒的間隔收集掃描結(jié)果。

4. 使用 UltraScan-III 軟件包通過內(nèi)部超級計算機計算分析所有數(shù)據(jù)。我們使用二維頻譜分析 (2DSA) 分析 SV-AUC 數(shù)據(jù)，同時去除時變噪聲、彎液面和底部位置，然后進行增強的 van Holde-Weischet 分析。我們用 UltraScan 估計了緩沖液密度和粘度校正（分別為 1.0269g/cm3 和 1.293 cP）。所有流體動力學(xué)參數(shù)均在 20°C 和水條件下校正為標(biāo)準(zhǔn)條件。

REFERENCE

Tyler Mrozowich, Sean M. Park, Maria Waldl, Amy Henrickson, Corey R. Nelson, Borries Demeler, Ivo L. Hofacker, Michael T. Wolfinger, Trushar R. Patel Cyclization studies of Japanese encephalitis virus non-coding RNA terminal regions.bioRxiv 2022.02.01.478553

Competitive inhibition of the classical complement pathway using exogenous single-chain C1q recognition proteins

利用外源性單鏈C1q識別蛋白競爭性抑 制經(jīng)典補體通路

發(fā)表日期：January 12, 2022

DOI:  doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102113

摘要：補體亞基C1q是一種先天免疫系統(tǒng)的蛋白復(fù)合體，具有特征良好的免疫結(jié)合特性，是構(gòu)成經(jīng)典補體通路的重要部分。最 近的研究發(fā)現(xiàn)不管是健康的還是神經(jīng)退行性疾病的大腦中，C1q在中 樞神經(jīng)中具有突觸消除的作用。然而,c1q相關(guān)的突觸吞噬分子機制還不清楚。在這里，我們設(shè)計了單體和多聚體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括球形頭部的小鼠C1q的識別部位(C1q球狀部分[gC1q]) 而缺乏膠原樣結(jié)構(gòu)的尾部的一條的單鏈分子(sc-gC1q蛋白)。這些在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的分子能競爭性抑 制C1q的功能，我們通過質(zhì)譜、分析型尺寸排阻色譜，分析型超速離心機，CD光譜，和ELISA等技術(shù)對其結(jié)構(gòu)和結(jié)合已知補體通路激活物的能力進行表征。我們進一步使用SPR技術(shù)分析了這些分子和免疫球蛋白、神經(jīng)元之間的相互作用。最 終，我們發(fā)現(xiàn)sc-gC1qs能夠特異性的抑 制C1q的活性。此外，sc-gC1qs與C1q相互競爭結(jié)合在胚胎神經(jīng)元細(xì)胞膜上。我們通過sc-gC1qs的體內(nèi)實驗揭示了C1q在神經(jīng)元的定位和功能方面的作用，具有潛在的抑 制劑治 療的用途。

目的：用于表征sc-gC1q蛋白的均一性和聚集狀態(tài)。

儀器型號：Optima XL-1

sc-gC1q(藍(lán)綠色)、sc-gC1q2(紫色)和sc-gC1q3(粉色) 在分析型超速離心實驗中沉降系數(shù)的分布情況。計算得到的sc-gC1q分子質(zhì)量為49.9±0.4 kDa與由氨基酸序列計算的理論分子量47,811 Da有很好的一致性。sc-gC1q2 分子質(zhì)量為94.9 ± 0.6 kDa,大部分為二聚體形式，只有少部分以單體存在。sc-gC1q3分子質(zhì)量51.1±0.5 kDa，也基本以單體存在。

實驗條件：

1. 對蛋白樣品進行透析，緩沖液為50mm磷酸鈉，200mm NaCl，測量前的pH值為7.5。

2. 25 ℃下3000 rpm (700g) 離心20 min穩(wěn)定溫度，之后45,000 rpm (156,000g)離心，237 nm吸收光檢測，步進0.003 cm，間隔10 min。

3. SEDNTERP計算溶液粘度和密度，SEDFIT擬合結(jié)果。

REFERENCE

Laue, T., Shah, B., Ridgeway, T., and Pelletier, S. (1992). In Computer aided Interpretation of Sedimentation Data for Proteins, Royal Society of Chemistry, Cambridge, U.K

Brown, P. H., and Schuck, P. (2006) Macromolecular size-and-shape distributions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Biophys. J. 90, 4651–4661

Amphiphilic Diblock Copolymers Bearing Poly(Ethylene Glycol) Block: Hydrodynamic Properties in Organic Solvents and Water Micellar Dispersions, Effect of Hydrophobic Block Chemistry on Dispersion Stability and Cytotoxicity

含聚(乙二醇)嵌段的兩親二嵌段共聚物:有機溶劑和水膠束分散體系中的水動力學(xué)性質(zhì)，疏水嵌段化學(xué)對分散穩(wěn)定性和細(xì)胞毒性的影響

發(fā)表日期：16 October 2022

DOI:https:// doi.org/10.3390/polym14204361

摘要：

盡管兩親性嵌段共聚物已經(jīng)通過各種方法在普通溶劑和水分散體系中進行了詳細(xì)的研究，但它們的流體動力學(xué)描述仍不完整。在這篇論文中，作者提出了一個詳細(xì)關(guān)于六種二嵌段共聚物流體動力學(xué)研究的方法，采用動態(tài)光散射，粘度法，分析型超速離心法研究了嵌段共聚物在四氫呋喃有機溶劑和水膠束體系中的分布狀態(tài)。此研究對于生物醫(yī)學(xué)，細(xì)胞毒性研究都有重要意義。

目的：利用分析超速離心(AUC)進行二嵌段共聚物聚集性與流體動力學(xué)研究

儀器型號：XL-I，An-60Ti，12mm鋁制中心件，2孔樹脂中心件

A：在20°C的四氫呋喃溶液中PS-b-PEG，PMMA-b-PEG, PE-b-PEG的沉降系數(shù)分布圖

B：在20°C的四氫呋喃溶液中PBd-b-PEO, PDMS-b-PEO, PCL-b-PEO的沉降系數(shù)分布圖

實驗條件：

1. 實驗使用貝克曼 ProteomeLab XL-I 分析型超速離心機，沉降速率法，An-60Ti 4孔轉(zhuǎn)頭，12mm鋁制中心件 (THF solutions), 2孔樹脂中心件(H2O, D2O/H2O)

2. 轉(zhuǎn)速設(shè)置范圍為15,000–60,000 rpm, 取決于不同試劑的具體實驗需求。在四氫呋喃溶液中使用最 大轉(zhuǎn)速。

3. 樣品與Buffer加樣量為420，20°C平衡溫度2h。

4. 使用干涉光學(xué)系統(tǒng)進行檢測

5. 使用 SEDFIT 軟件c(s)模式分析數(shù)據(jù)

REFERENCE

Elistratova, A.A.; Gubarev, A.S.; Lezov, A.A.; Vlasov, P.S.; Solomatina, A.I.; Liao, Y.-C.; Chou, P.-T.; Tunik, S.P.; Chelushkin, P.S.; Tsvetkov, N.V. Amphiphilic Diblock Copolymers Bearing Poly(Ethylene Glycol) Block: Hydrodynamic Properties in Organic Solvents and Water Micellar Dispersions, Effect of Hydrophobic Block Chemistry on Dispersion Stability and Cytotoxicity. Polymers 2022, 14, 4361. https:// doi.org/10.3390/polym14204361

Development of a SARS-CoV-2 Vaccine Candidate Using Plant-Based Manufacturing and a Tobacco Mosaic Virus-like Nano-Particle

使用基于植物制造和煙草花葉病毒樣納米顆粒開發(fā)SARS-CoV-2候選疫苗

發(fā)表日期：17 November 2021

DOI：https://doi.org/10.3390/vaccines9111347

摘要：

穩(wěn)定、有效、易于制造的疫苗對于阻止由冠狀病毒 SARS-CoV-2 引起的 COVID-19 大流行至關(guān)重要。我們構(gòu)建了一種候選疫苗 CoV-RBD121-NP，它由刺突糖蛋白 (S) 的 SARS-CoV-2 受體結(jié)合域 (RBD) 與人 IgG1 Fc 域 (CoV-RBD121) 融合并結(jié)合到改良的煙草花葉病毒 (TMV) 納米顆粒上。在體外，CoV-RBD121與宿主病毒受體ACE2和單克隆抗體 CR3022 結(jié)合，CR3022 是一種阻斷S與 ACE2 結(jié)合的中和抗體。CoV-RBD121-NP候選疫苗保留了關(guān)鍵的SARS-CoV-2刺突蛋白表位，具有一致的安全性、一致性和強度，并且在 2–8°C 或 22–28°C下儲存 12 個月時顯示出穩(wěn)定的效力。免疫原性研究表明，在使用非佐劑或佐劑 (7909 CpG)后，C57BL/6小鼠產(chǎn)生了強烈的抗體反應(yīng)。非佐劑疫苗誘導(dǎo)了平衡的 Th1/Th2 反應(yīng)和識別 SARS2-CoV-2 的 S1 結(jié)構(gòu)域和完整 S 蛋白的抗體，而佐劑疫苗誘導(dǎo)了 Th1 偏向反應(yīng)。佐劑和非佐劑疫苗均誘導(dǎo)病毒中和滴度，如通過三種不同的測定法所測量的。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，通過 SARS-CoV-2 RBD 與 TMV 樣納米顆粒的結(jié)合，可以生產(chǎn)穩(wěn)定的 COVID-19 候選疫苗。

儀器型號：ProteomeLab XL-A 分析超速離心機、AN-50Ti轉(zhuǎn)子

CoV-RBD121-NP 的物理特性

(A)TMV Ntk病毒體和CoV-RBD121-NP（與抗原結(jié)合后的病毒體）的透射電子顯微鏡結(jié)果。黃色箭頭表示結(jié)合抗原的位置）。比例尺 = 200 納米。

(B) CoV-RBD121-NP 在釋放時以及在 2–8 °C下儲存后1個月和3個月的大小分布。根據(jù)分析超速離心(AUC)后的曲線下面積計算分布。

(C) CoV-RBD121-NP在2-8 °C或22-28 °C下儲存后6個月或12個月的尺寸分布?；贏UC分析的百分含量。

AUC實驗條件：

1. 將 TMV NtK 和結(jié)合疫苗稀釋至目標(biāo)濃度，并使用光程為12 mm的2通道樹脂中心件，將樣品加載到樣品池中。

2. 加載的樣品池被放置在AN-50Ti轉(zhuǎn)子中，并在Beckman-Coulter ProteomeLab XL-A 分析超速離心機中以 9000rpm 的速度分離。

3. 每 4 分鐘記錄一次掃描，持續(xù)4 小時（每個樣本 60 次掃描）。

4. 數(shù)據(jù)使用 SEDFIT (vs. 11.3) 軟件（美國國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)，馬里蘭州，美國）進行分析。

5. 勾選f/f0 值擬合，以找到每個樣本數(shù)據(jù)最適合的擬合結(jié)果。

6. 使用的置信區(qū)間為0.683，勾選擬合time-invariant noise。

7. 使用 OriginLab Origin vs. 9.0.0（OriginLab, Northampton, MA, USA）繪制所得尺寸分布圖，并對峰積分。

REFERENCE

Royal JM, Simpson CA, McCormick AA, Phillips A, Hume S, Morton J, Shepherd J, Oh Y, Swope K, DeBeauchamp JL, Webby RJ, Cross RW, Borisevich V, Geisbert TW, Demarco JK, Bratcher B, Haydon H, Pogue GP. Development of a SARS-CoV-2 Vaccine Candidate Using Plant-Based Manufacturing and a Tobacco Mosaic Virus-like Nano-Particle. Vaccines (Basel). 2021 Nov 17;9(11):1347.

Subunit Flexibility of Multimeric von Willebrand Factor/Factor VIII Complexes

多聚血管性血友病因子/因子VIII復(fù)合物的亞基柔韌性

作者：Ernest T. Parker, Sandra L. Haberichter, and Pete Lollar

發(fā)表日期：25 August 2022

DOI: https://doi.org/10.1021/acsomega.2c03389

摘要：

血管性血友病因子(VWF)是一種參與血小板粘附和聚集的血漿糖蛋白，是凝血因子VIII (blood coagulation factor VIII, fVIII)的載體。血漿VWF由多聚體組成，分子量從~ 0.55 MDa到10 MDa以上。VWF多聚物由一個可變數(shù)量的二硫連接~ 275 kDa的子基組成。本文在pH為7.4的條件下，用色譜法對血漿源性人VWF/fVIII配合物進行分離，并對其進行凝膠電泳、沉降速率法分析超離心(SV AUC)、動態(tài)光散射(DLS)和多角度光散射(MALS)檢測。本研究結(jié)果與非流動條件下VWF多聚物模型的結(jié)果一致，在非流動條件下，多聚物具有顯著的靈活性。對于同源系列聚合物，如VWF多聚體的分布，分子質(zhì)量與回轉(zhuǎn)半徑、沉降系數(shù)或用擴散系數(shù)作為大分子的診斷指標(biāo)構(gòu)象。

目的：表征VWF多聚物

型號：Beckman?Coulter XLI

實驗條件：20°C，上樣量400uL, 吸光度280nm, 使用sedfit進行分析，置信區(qū)間設(shè)置0.68

實驗結(jié)果：

圖1：sepacryl S-1000 VWF/FVIII樣品, 280 nm處從左到右的吸光度掃描原始數(shù)據(jù)

圖2：c(s) 模型擬合后得數(shù)據(jù)，樣品1 (藍(lán)色), 9 (綠色), 13 (紅色)

圖3：VWF/fVIII Complexes 的SV AUC數(shù)據(jù)匯總

Bibliography

Parker, E.T., Heritier, S.L. and Lollar, P., 2022. Subunit flexibility of multimeric von Willebrand factor/factor VIII complexes. ACS omega, 7(35), pp.31183-31196.

SV-AUC as a stability-indicating method for the characterization of mRNA-LNPs

SV-AUC作為一種表征mRNA-LNPs穩(wěn)定性的可行方法

發(fā)表日期：14 November 2022

DOI:doi.org/10.1016/j.ejpb.2022.11.014

摘要：

在SARS-CoV2大流行期間，以包裹mRNA的脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)形式生產(chǎn)的mRNA疫苗，開創(chuàng)了一個新的疫苗領(lǐng)域。對于LNPs大小和結(jié)構(gòu)變化進行定量分析是至關(guān)重要的，因為這些參數(shù)的變化可能對疫苗的效價產(chǎn)生影響。本項研究中，我們使用分析超離心機，以沉降速度 (SV-AUC)的方法對mRNA-LNP疫苗在相關(guān)應(yīng)激因素(凍融、熱、機械應(yīng)力等)作用下的結(jié)構(gòu)變化進行了穩(wěn)定性定量分析，同時對比了DLS的相關(guān)數(shù)據(jù)。DLS能夠準(zhǔn)確的對mRNA-LNPs的大小和均一性進行表征。在壓力因素下，如凍融和機械應(yīng)力的作用下，DLS和SV-AUC都能檢測到顆粒粒徑和大顆粒物含量的增加。而50℃熱應(yīng)力的變化僅通過SV-AUC浮選的速率的變化被檢測到。此外，SV-AUC可以觀察到顆粒密度的變化，這是DLS無法檢測到的?？傊?，SV-AUC是一種很有價值的mRNA-LNPs穩(wěn)定性定量表征方法。

目的：表征mRNA-LNPs的應(yīng)激穩(wěn)定性

儀器型號：Optima AUC，AN-50 Ti轉(zhuǎn)子

SV-AUC對mRNA-LNPs進行表征數(shù)據(jù)

不同應(yīng)激條件下，通過SV-AUC對主峰和高分子量峰1進行量化。

實驗條件：

20℃下，將樣品和buffer溶液放入帶藍(lán)寶石窗口的雙區(qū)中心件，在AN 50-Ti 轉(zhuǎn)子上以每分鐘 10,000 轉(zhuǎn)下進行離心，檢測260 nm and 280 nm吸收峰，檢測間隔120 s，檢測間隔10 μm。

使用UltraScan III對前95條數(shù)據(jù)進行分析，使用2DSA模型，對時間和徑向噪音進行擬合。在最 終的擬合計算中，使用CSA-SL-MC模型，選擇范圍：1 S到 200 S (主峰), 200 S到1200 S(高分子量峰1) ，1200 S到2000 S (高分子量峰2)。通過計算得到加權(quán)平均沉降系數(shù)和摩擦系數(shù)比(f/f0)，以及相對含量。

REFERENCE

E. Brookes, W. Cao, B. Demeler, A two-dimensional spectrum analysis for sedimentation velocity experiments of mixtures with heterogeneity in molecular weight and shape, Eur. Biophys. J. 39 (3) (2010) 405–414.

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　　人Ⅰ型膠原試劑盒操作注意事項:

　　1、試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

　　2、實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。

　　3、不同批號的試劑不要混用。

　　4、人Ⅰ型膠原試劑盒保質(zhì)前使用。

　　5、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

　　6、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。

　　7、實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

　　人Ⅰ型膠原試劑盒樣品收集、處理及保存方法:

　　1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

　　2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　3、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘。

　　4、取上清液保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。

　　注意：盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　人Ⅰ型膠原試劑盒性能：

　　1、靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.1 ng/mL。

　　2、特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

　　3、重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

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       LSA200采用6.5倍變焦光學(xué)鏡頭，6.5倍變焦鏡頭提供了一個理想的可變視野范圍，結(jié)合高分辨率高速相機和高亮度高均勻LED光源，再加上精確可靠的調(diào)焦指示，可以確保得到高質(zhì)量的清晰圖像，為準(zhǔn)確、可靠的測量奠定基礎(chǔ)。6.5倍變焦光學(xué)鏡頭適合各種不同的測量任務(wù)，比如對需要較小視野范圍的小尺寸液滴的測量和需要較大視野范圍的傾斜狀態(tài)下液滴滑動速度的測量。

       LSA200光學(xué)接觸角測量儀從自動加液系統(tǒng)、自動樣品升降臺、自動樣品傾斜臺，到自動樣品離心旋轉(zhuǎn)臺，再到軟件支持的各種自動測量方法，覆蓋了從全手動操作到全自動測量的范圍廣泛的各種應(yīng)用領(lǐng)域。

齊全的配件和功能強大的擴展模塊，使得LSA200依照不同的配置和擴展模塊可以擴展為各種儀器，比如全自動接觸角測量儀，雙視法接觸角測量儀，全自動臨界膠束濃度測量儀，光學(xué)粘滯力測量儀等等。