從事口罩微生物檢測的朋友都知道，在菌落總數(shù)檢測時，經(jīng)常添加TTC這種物質(zhì)，哪什么是TTC？添加TTC又有什么作用？

TTC：俗稱紅四氮唑，學(xué)名2,3,5-三苯基氯化四氮唑，化學(xué)式如下：

在菌落總數(shù)檢測時，添加TTC可以起到兩方面的作用：

其一，TTC可以使菌落顯紅色，便于區(qū)分菌落和雜質(zhì)，更利于計數(shù)；

其二，TTC可以有效的防止平板上的菌落蔓延情況。這兩種作用的原理是不同的，TTC溶于水是無色的，而嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶可以使無色的TTC被還原成紅色的TPF，使菌落顯色，這是顯色的原理；同時TTC還具有YZ某些革蘭氏陽性菌生長的作用，因此會防止菌落蔓延。但既然會YZ細(xì)菌的生長，那會不會造成檢測誤差呢？其實只要合理使用，注意添加量，對檢測結(jié)果的影響并不是很大，是可以忽略不計的。

有專家對此做過實驗，實驗結(jié)果表明培養(yǎng)基內(nèi)TTC濃度在0.0003%-0.001%（w/v）的范圍內(nèi)對菌落生長YZ作用不顯著，但濃度太低菌落的顯色效果并不是很好，因此推薦大家按照TTC濃度為0.0005%的量來添加就不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響，還會使菌落顯色方便計數(shù)。為了方便大家在檢測過程中方便添加，潤揚儀器小科特意做了一個表格，方便大家查詢：

除了添加量之外，菌落總數(shù)檢測時使用TTC過程中我們還應(yīng)該注意以下幾點：

要點1：TTC的配制過程，一定要在無菌條件下進行。因為我們配制好的TTC溶液在檢測時是直接加入到培養(yǎng)基中的，必須保證TTC溶液時無菌的，配制用水也必須是無菌水。

要點2：TTC具有比較強的光敏性，見光易分解，因此無論是TTC粉末還是配制好的TTC溶液都要注意避光冷藏保存，配制好的溶液一定要放在棕色的試劑瓶里。

要點3：TTC溶液要在菌落總數(shù)檢測過程中直接加入滅菌完的培養(yǎng)基中，即在傾倒平皿之前加入培養(yǎng)基然后搖勻使用。盡量不要將TTC溶液加入培養(yǎng)基后一起滅菌，這樣操作會使培養(yǎng)基顏色加深，不利于顯色和計數(shù)。

要點4：若顯色效果不是很好，可以考慮提高一下TTC濃度，但不要超過0.001%的濃度，否則會使檢測結(jié)果出現(xiàn)比較大的偏差。

要點5：加TTC溶液還可以有效的控制平板培養(yǎng)基上的菌落蔓延情況，若是添加試劑的主要目的是為了控制菌落蔓延，建議增加培養(yǎng)基中TTC的濃度，濃度大約0.0008%時就會起到比較好的效果，并且不會影響結(jié)果。

任何方法都會是雙刃劍，添加TTC顯色當(dāng)然也是如此，添加TTC蕞主要的問題就是它的YJ作用，會造成檢測結(jié)果偏低，因此很多人不愿使用。其實若是不存在雜質(zhì)干擾或者一些特殊情況可以比較準(zhǔn)確的計數(shù)，潤揚儀器小科也建議大家不要一昧因為顯色之后容易計數(shù)就進行添加，畢竟這只是在一些特殊情況下采用的非常規(guī)手段。

　　菌落總數(shù)(Totalcoliforms)是判定水質(zhì)被細(xì)菌污染程度的重要指標(biāo)之一，其測定方法也有一定的標(biāo)準(zhǔn)。平皿計數(shù)法是早期傳統(tǒng)的水中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，其應(yīng)用研究也比較多，如錢冬梅應(yīng)用平皿計數(shù)法測定了生活飲用水中的菌落總數(shù)。這種方法實驗步驟較為繁瑣，對操作人員的專業(yè)水平要求比較高，不適用于應(yīng)急快速檢測，無法對水的衛(wèi)生狀況做出快速評價。

　　酶底物法是近些年來新興的水中菌落總數(shù)檢測方法，操作簡便，結(jié)果易判斷，適用于快速檢測。但不少用戶對此種方法存疑，不知道這種方法出來的檢測結(jié)果是否科學(xué)準(zhǔn)確，下面優(yōu)爾普就以平皿計數(shù)法的檢測結(jié)果為準(zhǔn)，用酶底物法程控定量封口機進行實驗檢測對比。

立科酶底物法程控定量封口機

酶底物法快速檢測水中菌落總數(shù)實驗

一、實驗操作部分

1、實驗原理

　　酶底物法使用的復(fù)合酶技術(shù)培養(yǎng)基包含多種獨特的酶物質(zhì)，每種酶物質(zhì)都針對不同的細(xì)菌酶設(shè)計(包含普遍的水介傳播細(xì)菌)，所有的酶底物被分解時均產(chǎn)生相同的信號。在檢測菌落總數(shù)時，這個信號顯示為365納米紫外4O城鎮(zhèn)供水NO.22013燈下的熒光。

2、材料與試劑

　　立科定量盤、lmL移液管或移液槍、10mL移液管或移液槍、培養(yǎng)箱(35±1)、6瓦366FIITI紫外燈、紫外燈箱(23cmx30onx17on1)、無菌水。

3、方法步驟

酶底物法檢測方法操作步驟

(1)首先向100mL裝有固體培養(yǎng)基的瓶中加入無菌水至刻度，搖勻，制成液體培養(yǎng)基，然后放置在冰箱中保存，使用有效期為5天。見圖1。

(2)取1mL水樣及9mL液體培養(yǎng)基倒入立科定量盤中。見圖2。

(3)將定量盤蓋好，在水平桌面上旋動將所有水樣分配到定量盤的孔中(孔中的氣泡不會影響結(jié)果)。見圖3。

(4)將定量盤豎起呈垂直90度，將多余的水樣由盤內(nèi)海綿吸收。見圖4。

(5)將定量盤緩慢翻轉(zhuǎn)過來，于培養(yǎng)箱中(35±0.5)培養(yǎng)48h(若結(jié)果為可疑陽性則延長培養(yǎng)時間至72h)。見圖5。

(6)計數(shù)：培養(yǎng)完成后將培養(yǎng)盤蓋打開，用紫外燈在定量盤上方13on處照射，數(shù)顯熒光的孔數(shù)。對照MPN表得出結(jié)果。注意：海綿條顯熒光不必記錄在讀數(shù)范圍內(nèi)。由于本方法的Zda檢測上限為738MPN/mL，如需稀釋時，將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為報告讀數(shù)(如稀釋l0倍時的操作為：加入0.1mL樣品和9.9mL液體培養(yǎng)基)。

二、結(jié)果與分析

1、盲樣比對實驗--T檢驗分析

　　選取三個水質(zhì)檢測實驗室對比同一盲樣(標(biāo)準(zhǔn)試劑)進行酶底物法和平皿計數(shù)法比對試驗，具體試驗結(jié)果如圖。

EPA標(biāo)準(zhǔn)盲樣檢測結(jié)果

　　對比以上酶底物法和平皿計數(shù)法檢出共160個結(jié)果進行配對T檢驗，兩種方法的配對T檢驗結(jié)果如下表。

配對檢驗結(jié)果

　　標(biāo)配比變量差值的T檢驗結(jié)果，Mean均值之間的差值為-1.78750，Std.Deviation差值的標(biāo)準(zhǔn)差16.10385，Std.ErrorMean差值的調(diào)準(zhǔn)誤為1.80047，95%ConfidenceIntervaloftheDifference置信區(qū)間上下限為-5.37124和1.79624，t-valuet值為-0.993，df自由度為79，Sig(2-tailed)雙尾T檢驗的結(jié)果，獲得t值的概率P值為0.324，檢驗結(jié)果表明酶底物法和平皿計數(shù)法檢測結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的差別(P<0.50)。

2、水樣檢測--線性回歸分析

　　采集地表水水樣進行檢測，為保證實驗結(jié)果的有效性和方便統(tǒng)計，要求檢測高、低濃度兩個水樣，同時，要求低濃度水樣的MPN值控制在50MPN/ml左右，高濃度水樣的MPN值控制在100MPN/ml左右，分別從國內(nèi)9個地區(qū)采集水樣，試驗結(jié)果如圖。

實驗室水樣檢測結(jié)果

　　對以上9家實驗室用酶底物法和平皿計數(shù)法共1160個檢測結(jié)果進行線性回歸統(tǒng)計分析，兩種方法線性回歸分析見下表。

檢測結(jié)果線性回歸統(tǒng)計分析

　　從圖表中可知，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)Beta為0.95，表明兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性較好，兩種方法的檢測結(jié)果具有可比性。檢驗結(jié)果P=0.00，均小于0.05，表明兩種方法在檢測菌落總數(shù)時沒有顯著差異性，具有等效性。此結(jié)果說明酶底物法的測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以替代平皿技術(shù)發(fā)作為水中菌落總數(shù)的測定方法。

　　從上述實驗可以看出，酶底物法快速檢測水中菌落總數(shù)的檢測結(jié)果與平皿計數(shù)法無統(tǒng)計學(xué)意義上的差別，是科學(xué)的、有效的、準(zhǔn)確的，可以用作評價水質(zhì)微生物污染的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。酶底物法操作簡單，結(jié)果判讀容易、準(zhǔn)確，無需稀釋即可檢測738個/1mL水樣，不僅適用于水源水、飲用水的檢測，還適用于應(yīng)急檢測和污水檢測，易于推廣，可以較好的彌補傳統(tǒng)方法的不足。