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  一只小鳥5711 2017-06-24 00:00:00

  病原微生物的分子分型方法 近年來，隨著分子牛物學技術快速發(fā)展，新的診斷技術和方法不斷涌現(xiàn)并廣泛應用于臨床微生物的檢測，為病原微牛物的致病性、流行性、變異性以及耐性分析等方面提供J，重要的信息。目前，應用分子生物學技術對病原微牛物進行分型的方法包括：脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gelelectrophoresis。PFGE)分型、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)分型、生物芯片分型、多位點序列分型(muhilocus sequencetyping，MI。ST)、質粒DNA圖譜分型以及限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型等。 1．脈沖場凝膠電泳分型PFGE技術以其重復性好、分辨力強而被譽為細菌分子分型的“金標準”。它可以用于大分子DNA的分離，其分辨范圍達到10 Mb，而普通瓊脂糖凝膠電泳僅能分離小于500 Kb的DNA。PFGE的基本原理是通過電場的不斷改變，使包埋在凝膠中的DNA分子的泳動方向發(fā) 生改變，小分子DNA比大分子DNA泳動快，從『『ii在凝膠上按DNA分子大小呈現(xiàn)出特異的電泳圖譜。病原微生物的基因組DNA經(jīng)脈沖場凝膠電泳，使大片段DNA有效分離。DNA條帶的密度反映了病原微生物基因組DNA的含量以及分子的大小，Z終達到分型的目的。目前，PFGE已被廣泛的應用于病原微牛物的分型，Swaminathan等∽J已經(jīng)建立了針對大腸桿菌0157：H7、沙門菌屬的Typhimurium血清型、李斯特菌、志賀菌屬等病原微生物分型的標準PFGE操作方法。有研究認 為PFGE的分辨力強于核糖體分型和隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分型。當采用1個限制件核酸內切酶的分辨力不強時，可以采用2種限制性核酸內切酶加以提高。當然，PFGE也有一些局限，如耗時長、成本高等。另外，電泳圖譜易受操作人員技術水平等因素的影響，這為不同實驗室問的比較帶米一定困難¨ 2．聚合酶鏈反脫分犁PCR技術自1985年發(fā)明以來，以其靈敏度高和特異性強受到了人們的高度重視，成為核酸擴增和檢測的一種常規(guī)方法H]。用于病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重復序列PCR分犁2種。RAPD是建移在PCR基礎卜-的1種可對整個未知序列的基因 組進行多態(tài)性分析的分子生物學方法。該方法以基岡組DNA為模板，以單個人T．合成的隨機多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基)為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚內烯酰胺凝膠電泳后，對其進行多態(tài)性分析。反應小同基因組DNA特點，從而對病原微生物進行分型。RAPD可以在物種沒有任何基因組信息的情況下分析其DNA多態(tài)性，對模板DNA的純度要求不高。無需DNA探針和分子雜交。重復序列PCR分型足Versalovic于1996 年描述的1種細菌基因組指紋分析方法，即PCR擴增細菌基因組中廣泛分布的短重復序列，經(jīng)電泳圖譜比較分析揭示基因組間的差異[5]。研究表明重復序列PCR分型與RAPD分型有相同的分辨力[6]，但操作相對復雜。然而，重復序列PCR分型的再現(xiàn)性非常好，這是RAPD無法比擬的。此外，多重PCR、巢式PCR等也呵用于病原微生物的分型，雖然各有長處，但也存在分辨力弱、重復性差、結果解析困難等不足，因此，還未廣泛應用于臨床。 3．生物芯片分型 生物芯片技術是將生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基岡組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質上形成生物分子點陣，當待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用后，利．}}j激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析例。其用于病原微生物分型的基本原理是將代表各個亞型的特異基因制成1張芯片，經(jīng)反轉錄就可檢測樣本中病原微生物的亞型進行辨別。液態(tài)芯片(suspension arraytechnology，SAT)，又稱微球蛋白芯片(proteinbeadarrays，PBA)，是近年來出現(xiàn)的1種新的芯片技術。其原理是甩2種熒光染料按照不同比例將直徑為5．6 ttm的微球染成100種顏 色，每種顏色的微球共價結合1種牛物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分針對1種待檢物。混合載有100種不同顏色的微球，就可以在1個反應孔里同時完成100種不同的生物反應。隨后微球成單列通過2束激光照射的管道，計算機采集并處理每種顏色微球的熒光強度變化就可以分別對每個待測物進行定性或定量的檢測。該系統(tǒng)口『用于多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯(lián)合檢測。目前，該方法已應用于臨床HPV的分型檢測。與固態(tài)芯片相比，液態(tài)芯片在反 應動力學、反應速度、檢測敏感性、穩(wěn)定性以及自動化程度方面都有較大的優(yōu)勢，因此，不少學者看好液態(tài)芯片的應用前景。 4．多位點序列分型 隨著DNA測序技術的快速發(fā)展，分子分型日益趨向于染色體的單一或多個位點的多態(tài)性上。MI。ST分型是指測定對多個管家基囡中長度約為470 bp的核心片段的核苷酸序列，對其組合進行索引編號，不同的菌株對應不同的序列型，從而揭示菌株間等位基因的多樣性。Maid—en等[83發(fā)現(xiàn)，MI，ST可用于腦膜炎奈瑟球菌的分型。他們認為，多個管家基因的序列分析比較在實驗過程的ⅡI操作性與結果的可靠性之間取得了平衡，且結果準確，所得數(shù)據(jù)在不同的實驗竄問具有良好的可比性，即MLST對某哆菌株具有較強的種內分辨力【9 J。Chen等no]應用MLST對我國臺灣地區(qū)12家分離到的51株白色假絲酵母菌進行遺傳特征分析，結 果發(fā)現(xiàn)了7個管家基因序列的83個多態(tài)性位點和45個二倍體序列類型。其中，36．1％是同義突變，63．9 oA為非同義突變。他們認為，MI。ST的分辨力較PFGE更強，能分辨某患者所感 染的白色假絲酵母菌隨時間推移『『ii發(fā)生的微小種內進化。但MLST的缺點是它的高額費用和操作過程所需的特定儀器。這使得這項技術只能局限在大型的性流行病學研究ZX 使用，影響其在推廣普及。 5．質粒DNA圖譜分型 細菌質粒分析是較早被使用的病原微牛物分子分型方法。該方法包括萃取質粒DNA和瓊脂糖凝膠電泳。由于不同菌株質粒DNA序列和大小不同， 通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質粒圖譜也不同，從而可以對不同菌株進行分型。菌株攜帶的質粒越多則質粒DNA圖譜分型方法的特異性越強。質粒網(wǎng)譜分型的優(yōu)點是操作相對簡單，只需要簡單的設備就可以完成，耗時短，費用低廉。但質粒圖譜分型有一難以克服的缺陷。即質?？梢宰园l(fā)的丟失、獲取以及在同種細菌甚至是在異種細菌之間轉移，這就造成了質粒圖譜的不穩(wěn)定性。另外，質粒圖譜型方法小能區(qū)分那些大小相同而DNA序列不同的質?！А?。 6．限制性片段長度多態(tài)性分型 RFI。P是指基因組DNA經(jīng)限制性核酸內切酶消化，消化后的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限制性核酸內切酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA，可以產(chǎn)生大量短的片段，通過電泳后得到的DNA圖譜可用于病原微生物的分型。幾乎所有 的病原微牛物分離株都町以通過這種方法分型，但由于基因組DNA巨大，酶切后產(chǎn)生的片段眾多，且含有大量的鶯疊片段，這使得蔚株間圖譜的一致性分析面I臨諸多用難口“。RFLP分 型分辨力弱于PFGE分型，且操作比較復雜。

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