三綜合試驗(yàn)箱是用于模擬環(huán)境條件下，對(duì)材料、元件或產(chǎn)品進(jìn)行老化、腐蝕等環(huán)境適應(yīng)性測(cè)試的設(shè)備。它集成了溫濕度、紫外光、鹽霧等多種實(shí)驗(yàn)功能，以確保產(chǎn)品在不同環(huán)境下的可靠性和耐久性。本文將探討三綜合試驗(yàn)箱的功能特點(diǎn)及其是否具備鹽霧測(cè)試功能，幫助讀者了解該設(shè)備的實(shí)際應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)，尤其是在鹽霧腐蝕實(shí)驗(yàn)中的作用。

什么是三綜合試驗(yàn)箱？

三綜合試驗(yàn)箱，顧名思義，是一款綜合性環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備，通常包括三個(gè)基本功能模塊：高低溫循環(huán)測(cè)試、濕度測(cè)試以及紫外光老化測(cè)試。其設(shè)計(jì)初衷是模擬各種惡劣環(huán)境條件，如極寒、高溫、高濕、紫外光照射等，以評(píng)估材料和產(chǎn)品在這些環(huán)境中的性能表現(xiàn)。是否包含鹽霧功能，卻是許多用戶關(guān)注的關(guān)鍵點(diǎn)。

三綜合試驗(yàn)箱中的鹽霧測(cè)試

對(duì)于需要進(jìn)行鹽霧腐蝕試驗(yàn)的產(chǎn)品或材料，鹽霧試驗(yàn)箱無疑是常見的選擇。鹽霧測(cè)試通過模擬海洋氣候中的鹽霧環(huán)境，來加速測(cè)試物品的腐蝕性能。三綜合試驗(yàn)箱并不完全等同于鹽霧試驗(yàn)箱。盡管三綜合試驗(yàn)箱提供了溫濕度、紫外線等環(huán)境模擬，但大多數(shù)三綜合試驗(yàn)箱并未專門設(shè)計(jì)用于鹽霧測(cè)試。

但這并不意味著三綜合試驗(yàn)箱無法進(jìn)行類似的鹽霧測(cè)試。部分高端三綜合試驗(yàn)箱可能會(huì)配備額外的鹽霧噴霧功能，使其能夠在測(cè)試過程中同時(shí)進(jìn)行鹽霧腐蝕實(shí)驗(yàn)。這類設(shè)備通過在溫濕度、紫外光等條件下加入鹽霧環(huán)境，能夠模擬更加復(fù)雜的多重環(huán)境影響，從而提供更為的耐腐蝕性能評(píng)估。

如何選擇適合的試驗(yàn)設(shè)備？

選擇是否使用三綜合試驗(yàn)箱，首先應(yīng)根據(jù)測(cè)試目的來判斷。如果您的產(chǎn)品或材料需要面對(duì)鹽霧腐蝕的實(shí)際環(huán)境影響，傳統(tǒng)的鹽霧試驗(yàn)箱可能更為適用。若您的產(chǎn)品不僅需要面對(duì)鹽霧腐蝕，還需要在多種復(fù)雜環(huán)境條件下進(jìn)行綜合測(cè)試，三綜合試驗(yàn)箱將是一個(gè)更加高效且綜合的選擇。需要注意的是，在選擇設(shè)備時(shí)，應(yīng)根據(jù)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)、設(shè)備功能以及預(yù)算進(jìn)行合理規(guī)劃。

結(jié)論

三綜合試驗(yàn)箱作為一種多功能的環(huán)境測(cè)試設(shè)備，具有模擬多種環(huán)境條件的能力，但是否具備鹽霧測(cè)試功能，取決于設(shè)備的具體配置和應(yīng)用需求。在選擇設(shè)備時(shí)，了解自身測(cè)試需求和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將幫助您做出更為明智的決策，確保測(cè)試結(jié)果的性和有效性。

細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，在類型和狀態(tài)上有很大差異。在大多數(shù)生物系統(tǒng)中，我們對(duì)細(xì)胞多樣性的認(rèn)識(shí)是不完整的，就像神經(jīng)系統(tǒng)（腦細(xì)胞）這樣的復(fù)雜組織[1]。單細(xì)胞識(shí)別和功能的表征，作為對(duì)每個(gè)細(xì)胞的功能和反應(yīng)的理解，將加速生物領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)。它可能是癌癥、腫瘤，幾何任何可能在細(xì)胞群中具有多樣性的東西。然而，今天的技術(shù)并不能提供一種簡(jiǎn)單的方法來同時(shí)分析大量的單個(gè)細(xì)胞?？焖佟⒖蓴U(kuò)展的液滴測(cè)序（Drop-Seq）這種方法可以用來表征具有許多細(xì)胞類型和狀態(tài)的復(fù)雜組織。

Drop-Seq的原理和好處
Drop-Seq是一種基于使用微流體技術(shù)的方法，通過將它們封裝在微小液滴中進(jìn)行平行分析，可以快速分析數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞。

這些納升級(jí)水性隔離室已用于微流體器件中的許多應(yīng)用：納米顆粒制造、乳液和泡沫、藥物輸送，但也作為PCR和逆轉(zhuǎn)錄的微小反應(yīng)室[3]。Drop-Seq使用液滴將細(xì)胞分隔成納升大小的反應(yīng)室，用于分析其mRNA轉(zhuǎn)錄物，同時(shí)使用分子條形碼策略記住轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞。通過這種技術(shù)，一個(gè)科學(xué)家每天可以制作10000個(gè)單細(xì)胞庫，實(shí)驗(yàn)并行進(jìn)行且簡(jiǎn)單。因此，該方法將允許為已知細(xì)胞類別和新的候選細(xì)胞亞型產(chǎn)生基因表達(dá)的分子圖譜。

Drop-Seq利用微流體的優(yōu)勢(shì)

（1）很短的時(shí)間內(nèi)有很高的吞吐量

（2）盡量減少昂貴樣品的消耗

Drop-Seq包含以下步驟

1. 從組織中制備單細(xì)胞懸浮液
2. 準(zhǔn)備條形碼引物（或者在微顆粒表面或者在內(nèi)部）
3. 使用微流體裝置將每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)地與一個(gè)微小條紋的微粒共同包覆或封裝在一個(gè)微小的液滴中
4. 一旦分離成液滴，裂解細(xì)胞，釋放它們的mRNA，然后與引物（primers）雜交。
5. 打破液滴并產(chǎn)生STAMP（附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組）
6. 放大STAMP
7. 測(cè)試和分析：使用STAMP條形碼推斷每個(gè)轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞

Drop-Seq可以使用2種beads：
A：“簡(jiǎn)單”的微粒
B：水凝膠微粒

該項(xiàng)工作的ZD是“簡(jiǎn)單”微粒的使用，并簡(jiǎn)要介紹了水凝膠微粒，其原理保持不變。

Drop-Seq使用簡(jiǎn)單的微粒
1. 從復(fù)雜的組織中準(zhǔn)備單細(xì)胞懸浮液
將復(fù)雜組織解離成單個(gè)細(xì)胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每個(gè)微粒包含超過108個(gè)單獨(dú)的引物，它們共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“細(xì)胞條形碼（cell barcode）”，但具有不同的獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符（UMI）。事實(shí)上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，這允許在STAMP形成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)胞條形碼，僅在相同微粒的所有引物上相同但與其他beads上的細(xì)胞條形碼不同，允許回復(fù)細(xì)胞的起源。每種引物上不同的UMI允許對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù)并鑒定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕獲mRNA并引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄。

細(xì)胞條形碼的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
為了產(chǎn)生細(xì)胞條形碼，將微粒庫重復(fù)分成四個(gè)大小相等的寡核苷酸合成反應(yīng)，向其中加入四個(gè)DNA堿基中的一個(gè)。然后，在每個(gè)循環(huán)后將微粒合并在一起，并進(jìn)行總共12次分裂-池循環(huán)（split-pool cycles）。結(jié)果是一個(gè)微粒庫，每個(gè)微粒具有4^12（16,777,216）個(gè)可能的DNA堿基序列之一。[4]

合成獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循環(huán)完成后進(jìn)行。將所有微粒一起進(jìn)行八輪簡(jiǎn)并合成，每個(gè)循環(huán)期間可獲得所有四種DNA堿基，使得每個(gè)單獨(dú)的引物接受4^8（65,536）種可能序列（UMI）中的一種。[5]

3. 微流體裝置
一旦單細(xì)胞懸浮液和微粒準(zhǔn)備就緒，使用定制設(shè)計(jì)的微流體裝置將單個(gè)細(xì)胞與微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

該裝置在它們分成離散的液滴之前連接兩路水相。層流防止在液滴形成之前混合兩種水相輸入，一路流相包含細(xì)胞，另一路流相包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼引物beads。

微流體裝置
組件列表
（1）倒置顯微鏡
（2）壓力控制器+3流量傳感器/三個(gè)注射泵
（3）3個(gè)falcon管/3mL注射器
（4）磁力攪拌系統(tǒng)
（5）用于實(shí)驗(yàn)裝置元件連接的微流體導(dǎo)管
（6）微流體配件和連接器
（7）PDMS共流微流體液滴生成裝置
（8）用于beads的100微米細(xì)胞過濾器
（9）用于細(xì)胞的40微米細(xì)胞過濾器
（10）計(jì)數(shù)室

實(shí)驗(yàn)裝置連接示意圖

4. 細(xì)胞裂解和RNA雜交
在液滴形成后，立即將每個(gè)細(xì)胞在液滴內(nèi)裂解并釋放其mRNA。然后，它們與其伴隨的微粒表面上的引物雜交。

5. STAMPS產(chǎn)生
為了一次有效地產(chǎn)生數(shù)千個(gè)STAMP，通過添加試劑來破壞液滴以使油-水界面不穩(wěn)定，并收集和洗滌微粒。然后將mRNA在一個(gè)反應(yīng)中一起逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成一組稱為“附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通過PCR反應(yīng)在池（pools）中擴(kuò)增條形碼化的STAMP，用于高通量mRNA測(cè)序，以分析任何所需數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞。

7. 測(cè)序和分析
使用高容量平行測(cè)序?qū)γ總€(gè)末端對(duì)得到的分子進(jìn)行測(cè)序。首先，將讀數(shù)與參考基因組比對(duì)以鑒定cDNA的起源基因。接下來，通過細(xì)胞條形碼組織讀數(shù)，并且對(duì)每個(gè)細(xì)胞中確定的每個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù)。這是UMI發(fā)揮作用的地方，避免從同一mRNA轉(zhuǎn)錄物中重復(fù)計(jì)數(shù)序列讀數(shù)。隨后，可以建立數(shù)字基因表達(dá)測(cè)量矩陣（每個(gè)細(xì)胞每個(gè)基因一個(gè)測(cè)量）用于進(jìn)一步的分析。

使用水凝膠微球的Drop-Seq測(cè)序
關(guān)于水凝膠beads的使用，操作原理或多或少與以上保持相同，即Z大的區(qū)別在于引物（primers），它們位于微粒內(nèi)而不是位于它們的表面上。

為此，微流體裝置由三個(gè)通道而不是兩個(gè)通道組成：
（1）帶beads的一個(gè)通道（Z關(guān)鍵的部分）
（2）把細(xì)胞帶入液滴的一個(gè)通道
（3）帶來我們需要進(jìn)行分析的化學(xué)試劑的一個(gè)通道

至于“簡(jiǎn)單微粒（simple microparticles）”的使用，水凝膠beads含有可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物，然后隨后對(duì)液滴內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行條形碼編碼，由此獲得作為RNA序列的拷貝的DNA序列的集合，并且現(xiàn)在通過它們來自哪一個(gè)液滴來對(duì)這些序列進(jìn)行分類。

然后，可以打破液滴并將整個(gè)細(xì)胞群作為大量樣品處理，知道每個(gè)細(xì)胞已被單獨(dú)編碼。

相關(guān)的資源
開源鏈接：McCarroll Lab

液滴測(cè)序：Droplet-Sequencing

參考論文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

微流控液滴技術(shù)是近年來在微流控芯片上發(fā)展起來的一種研究幾微米至幾百微米尺度范圍內(nèi)微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)。微液滴常作為微反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)生化反應(yīng)、試劑快速混合以及微顆粒合成等，極大地強(qiáng)化了微流控芯片的低消耗、自動(dòng)化和高通量等優(yōu)點(diǎn)。本次網(wǎng)絡(luò)課堂主要介紹了微流控液滴的動(dòng)態(tài)分析部分如速度場(chǎng)、表面活性劑等知識(shí)。