參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  寒煙殘雪入紅塵 2016-12-21 00:00:00

  多糖樣品做凝膠層析為什么會有多個洗脫峰 凝膠層析操作中應(yīng)注意的一些具體問題. (1)層析柱的選擇 層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進(jìn)行選擇.一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難.一般柱長度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用.層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間.用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短. (2)凝膠柱的鑒定 凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關(guān)于填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定.凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡.另外通?？梢圆捎靡环N有色的物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度.如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱.另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質(zhì)預(yù)先過柱，以消除吸附. (3)洗脫液的選擇 由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強(qiáng)度和選擇性的改變來進(jìn)行分離，在凝膠層析中流動相只是起運(yùn)載工具的作用，一般不依賴于流動相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴(yán)格.由于凝膠層析的分離機(jī)理簡單以及凝膠穩(wěn)定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析.為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽. (4)加樣量 關(guān)于加樣前面已經(jīng)有所介紹，要盡量快速、均勻.另外加樣量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低.加樣量的多少要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求而定：凝膠柱較大，當(dāng)然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％.如果有條件可以首先以較小的加樣量先進(jìn)行一次分析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量.設(shè)要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那么加樣量不能超過(Ve1－Ve2).實(shí)際由于樣品擴(kuò)散，所以加樣量應(yīng)小于這個值. 從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提GX率，可以適當(dāng)增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量.另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱.樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果.

  贊(17)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論