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  云胞咸云 2017-06-06 00:00:00

  半定量pcr內(nèi)參基因擴(kuò)增條件和目的基因擴(kuò)增條件一樣以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR.根據(jù)反應(yīng)體系是否設(shè)有參照物以及是否與標(biāo)本在同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，定量PCR可分為四種：①有限稀釋法，即倍比稀釋法：通過(guò)稀釋陽(yáng)性樣品直至靶基因不能再擴(kuò)增為止，來(lái)設(shè)置已知濃度的參照品；根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果的Z大稀釋度及內(nèi)參標(biāo)或外參標(biāo)的極限檢出底線，計(jì)算出待檢標(biāo)本中原始模板的分子數(shù)；利用Z大稀釋度來(lái)進(jìn)行標(biāo)本核酸定量時(shí)的注意點(diǎn).優(yōu)點(diǎn)是不需要特殊設(shè)備，缺點(diǎn)是擴(kuò)增反應(yīng)條件要標(biāo)準(zhǔn)化，嚴(yán)格注意污染，避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生.②使用外參照物的定量PCR，以已知濃度的目的基因?yàn)槟０?，按一定的倍比稀釋，然后做出?biāo)準(zhǔn)曲線圖，未知的標(biāo)本按這標(biāo)準(zhǔn)曲線找出對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù).熒光定量PCR通常使用該法做標(biāo)準(zhǔn)曲線.③使用非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)參照物的定量：PCR反應(yīng)條件同樣，在同一試管內(nèi)，用兩對(duì)引物，同步擴(kuò)增來(lái)自同一DNA的一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo)序列.通過(guò)比較兩種序列的擴(kuò)增產(chǎn)量可對(duì)靶序列定量.方法A、設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增靶基因及無(wú)關(guān)基因的引物，優(yōu)化引物配比的條件.方法B、在指數(shù)增長(zhǎng)期實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因及一系列已知含量無(wú)關(guān)基因的PCR擴(kuò)增.方法C、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，EB染色.方法D、電泳條帶的紫外光下分析.方法E、二者熒光強(qiáng)度相等管的DNA含量亦相等.該方法只有當(dāng)靶序列和內(nèi)標(biāo)序列以相同的量存在時(shí)，才能對(duì)兩者相對(duì)定量；也是對(duì)處于擴(kuò)增指數(shù)期的PCR產(chǎn)物定量.④使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)參照物的定量PCR：同樣的反應(yīng)條件，同一個(gè)試管，用同一對(duì)引物，同步擴(kuò)增靶序列和內(nèi)參照序列.靶基因的量可通基本條件是靶序列和競(jìng)爭(zhēng)性序列均用相同的引物以相同的效率擴(kuò)增，兩序列的初始化比值在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中保持不變.目的DNA內(nèi)參照DNA變性（同一對(duì)引物）PCR競(jìng)爭(zhēng)性模板的設(shè)置：通過(guò)改變克隆的靶基因的序列來(lái)設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)性模板插入新的限制性酶切位點(diǎn)或使原來(lái)的酶切位點(diǎn)缺失通過(guò)基因重組技術(shù)插入一個(gè)與特異性蛋白結(jié)合的DNA片段，或者使靶序列發(fā)生定點(diǎn)誘變?nèi)斯ず铣筛?jìng)爭(zhēng)性模板.競(jìng)爭(zhēng)性模板設(shè)計(jì)目的：使其與靶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相區(qū)別（通過(guò)酶切、雜交、顯色等手段實(shí)現(xiàn)）.常用的熒光定量為T(mén)aqMan探針技術(shù)，他特異的和目的片段結(jié)合，只是用的是TaqMan.半定量RT-PCR用做內(nèi)參照，也應(yīng)該是第三種，只是它是普通PCR，通過(guò)電泳的條帶強(qiáng)弱，與GAPDH的比值，分析他們的灰度值半定量，個(gè)人認(rèn)為數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)該用TaqMan做相對(duì)定量或定量.用rt-pcr比較兩株細(xì)胞表達(dá)量的差異的時(shí)候，不一定要把兩株細(xì)胞調(diào)整為相同濃度，因?yàn)橐鰞?nèi)參照，可以校正模板量的差異

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