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  小女學(xué)畫 2012-12-24 00:00:00

  拷貝數(shù)是指某基因在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù)

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  scnud19 2012-07-04 00:00:00

  用我自己理解的話來(lái)說(shuō) 就是一段基因在基因組中出現(xiàn)的次數(shù) 如果基因組中這段基因只出現(xiàn)一次就是單拷貝 出現(xiàn)兩次及以上就是多拷貝了

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  go小飛454 2007-04-17 00:00:00

  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)用于檢測(cè)插入的外源基因拷貝數(shù) 自 1994 年，diyi例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品 Flavr Savr TM 西紅柿在美國(guó)上市，到 2003 年底，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物已遍布 18 個(gè)國(guó)家和地區(qū)，種植面積達(dá) 167.2 萬(wàn)英畝 (6770 萬(wàn)公頃 )( Ewen SWB，1999; 北國(guó)網(wǎng) ) 。大量實(shí)踐使得植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已有了比較經(jīng)典和成熟的技術(shù)路線。除了在商業(yè)領(lǐng)域內(nèi)獲得抗性植株外，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)還延伸到植物生理學(xué)研究（生化反應(yīng)途徑、植物抗病、抗逆性）以及生物反應(yīng)器研究（藥物、疫苗等）中（ Khachatourians 2002 ）。 一般經(jīng)過(guò)上游表達(dá)載體的設(shè)計(jì)構(gòu)建以及下游轉(zhuǎn)化體系的建立、轉(zhuǎn)化品系的篩選鑒定等一系列步驟后，即獲得 T 0 代轉(zhuǎn)基因植物。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，外源 DNA 隨機(jī)插入植物基因組內(nèi)，插入的拷貝數(shù)和位點(diǎn)都不固定。插入外源基因的拷貝數(shù)低（ 1 或 2 個(gè)）能較好的表達(dá)，插入的拷貝數(shù)多則會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的不穩(wěn)定甚至基因沉默現(xiàn)象（ Flavell 1994 ， Vaucheret et al 1998 ）。因此，檢測(cè) T 0 代轉(zhuǎn)基因植物的外源基因的拷貝數(shù)是研究其分子特性的基礎(chǔ)步驟之一。 Southern blot 是一種常用的 DNA 定量的分子生物學(xué)方法。其原理是將待測(cè)的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的有無(wú)、強(qiáng)弱可以對(duì)樣品定性、定量，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)。 Southern 法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。另外，由于 Southern 法檢測(cè)不經(jīng)過(guò)靶片段的擴(kuò)增（ PCR ），一般每個(gè)電泳通道需要 10-30 μ g 的 DNA ，在實(shí)際操作中就需要較大量的植物材料來(lái)提取 DNA ，而轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織在無(wú)菌條件下經(jīng)過(guò)篩選、重新分化后一般都比較細(xì)弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時(shí)發(fā)生基因重組，造成限制性酶切位點(diǎn)丟失， Southern 法也無(wú)法檢測(cè)到。這些因素都制約了 Southern 法在 T 0 代轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)是一種較新的 DNA 定量方法。其定量的基本原理是在 PCR 反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如： SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如： Taqman 探針），實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光量的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號(hào)（閾值）時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)： CT 值（ Cycle Threshold ）；通過(guò)將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 CT 值與其濃度的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效擴(kuò)增低拷貝的靶片段 DNA ，對(duì)每克樣品中 20pg-10ng 的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行有效檢測(cè)。同時(shí)，與 Southern 法相比，熒光定量 PCR 技術(shù)可對(duì) T-DNA 的不同序列進(jìn)行擴(kuò)增，因此能實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因品系中的基因重組的檢測(cè)（ Giovanna 2002 ）。 選擇一種合適的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，是應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)準(zhǔn)確定量模板初始濃度的基礎(chǔ)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家做了不同的嘗試。 P Song （ 2002 ）等人認(rèn)為：理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該是已插入外源基因的植物基因組 DNA ，并且用 Southern blot 準(zhǔn)確測(cè)得插入的外源基因拷貝數(shù)。但是在實(shí)際研究中，很難得到這樣一套標(biāo)準(zhǔn)品。因此，他提出替代方案，根據(jù)外源基因拷貝數(shù)和野生型植物基因組 DNA 的大小，按一定濃度比率混合，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，在轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因拷貝數(shù)研究中他們發(fā)現(xiàn)：在加入熒光染料 SYBR GREEN I 的 20 μ L PCR 反應(yīng)體系中，應(yīng)以 6 ng 野生型玉米基因組 DNA 作為模板量。已知玉米基因組 DNA 大小為 2.5 × 10 9 bp （ Armuganathan and Earle 1999 ），相應(yīng)于 6 ng 的玉米基因組 DNA ，即可計(jì)算出模擬 1 ， 2 ， 4 ， 8 ， 16 個(gè)外源基因拷貝時(shí)，應(yīng)加入的質(zhì)粒 DNA 的量。以這些梯度混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，就可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品的濃度并計(jì)算插入的拷貝數(shù)了。實(shí)驗(yàn)表明，用這種方法獲得的數(shù)據(jù)和 Southern blot 的結(jié)果相當(dāng)一致。 Giovanna （ 2002 ）將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因番茄作為研究材料，選擇了雙元載體 T-DNA 區(qū)上的兩個(gè)外源基因： TSWV-N （ Tomato spotted wilt virus ）、 npt Ⅱ ( neomycin phosphoril-transferase Ⅱ ) 和一個(gè)單拷貝的內(nèi)源基因（ endogenous gene ）作為熒光定量 PCR 擴(kuò)增的模板，檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)。他認(rèn)為使用植物基因組 DNA 和一定比例質(zhì)粒的混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，會(huì)累積許多無(wú)法避免的誤差。比如使用這種標(biāo)準(zhǔn)品必需預(yù)先知道待測(cè)植物基因組 DNA 的精確分子量，并對(duì)植物基因組 DNA 和質(zhì)粒準(zhǔn)確定量，但在大多數(shù)情況下得到的數(shù)據(jù)都只是近似值，再以此混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)每一轉(zhuǎn)基因植株的外源基因拷貝數(shù)時(shí)，就會(huì)放大這些誤差。 因此，他提出"相對(duì) CT "或" δ-δCT "的方法，這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要為每次實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只需要一個(gè)優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的，至少是相似的反應(yīng)效率即可。使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)先測(cè)得同一模板的目標(biāo)基因和內(nèi)源基因的相對(duì)比值： R line = SQ trans /SQ end 其中 SQ trans 為樣品中外源基因（ TSWV-N 和 npt Ⅱ ）的濃度； SQ end 為樣品中內(nèi)源基因（ endogenous gene ）的濃度。 C trans = （ SQ trans × V ） /M trans C end = （ SQ end × V ） /M end C trans ： C end = （ SQ trans /SQ end ）×（ M end / M trans ） 其中， C trans ， C end 分別為外源基因和內(nèi)源基因的拷貝數(shù)； M trans 和 M end 分別為外源基因和內(nèi)源基因的分子量。因?yàn)閮?nèi)源基因?yàn)閱慰截悾?SQ trans /SQ end 的比值就與外源基因的拷貝數(shù)成正比。 δR line = R line [(δ SQ trans /SQ trans ) 2 + (δ SQ end / SQ end ) 2 ] 1/2 應(yīng)用以上公式可計(jì)算出 R line 的標(biāo)準(zhǔn)偏差 δR line 。 Z后，還需要知道單拷貝外源基因 R line 值，與每一個(gè)體的 R line 值做比較，計(jì)算出其準(zhǔn)確拷貝數(shù)。即使用已知是單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株，計(jì)算出其 R lin e 作為校正參數(shù) R cal （ calibrator ），然后將 R cal / R line 的比值作為該品系的拷貝數(shù)?？墒沁@種方法會(huì)將 R cal 值計(jì)算過(guò)程中的得到的初始濃度的誤差不可避免的帶到以后每一個(gè)品系的計(jì)算中去，造成結(jié)果的集體偏差。為此，使用下面的公式計(jì)算出 R 1 值，即單拷貝外源基因的 R line 值來(lái)替代原先的 R cal ： F(R 1 ) = ∑ lines [R line /R 1 -N(R line /R 1 )] 2 / (δR line ) 2 其中， N(R line /R 1 ) 是Z接近 R line /R 1 的整數(shù)。經(jīng)計(jì)算， npt Ⅱ 基因的 R 1 值為 0.31 ； TSWV-N 基因的 R 1 值為 0.21 。將 R 1 /R line 代入公式即可知兩個(gè)基因在該植株中的拷貝數(shù)。由于 npt Ⅱ 基因與 TSWV-N 基因都位于雙元質(zhì)粒的 T-DNA 區(qū)，若是同一植株的兩個(gè)基因拷貝數(shù)不同，很可能就是在質(zhì)粒整合的過(guò)程中發(fā)生了重組。 與 Southern blot 法相比，這種方法更為靈敏。 與其他檢測(cè)方法相比， Giovanna 在實(shí)驗(yàn)中需要優(yōu)化的條件少、誤差小，可以得到有效、可靠的數(shù)據(jù)。另外，通過(guò)同時(shí)檢測(cè) T-DNA 上的兩個(gè)外源基因： TSWV-N 和 npt Ⅱ 的拷貝數(shù)，還可以有效評(píng)估外源基因的重組情況。 參考文獻(xiàn) • Ewen SWB， Pusztai A. Effect of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus Nivalis lectin in rat small intestine. (1999) The Lancet 354， 1353-1354. • 北國(guó)網(wǎng) http://economy.lnd.com.cn/economy/ZX/200401/1518220040115.htm • Khachatourians GG， McHughen A， Scorza R . Transgenic plants and crops. ( 2002) New York (USA)， Marcel Dekker . • Flavell RB : Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication . (1994) Proc Natl Acad Sci USA ， 91 ， 3490 3496 . • Vaucheret H， Béclin C， Elmayan T， Feuerbach F， Godon C， Morel JB， Mourrain P， Palauqui JC， Vernhetters S : Transgene-induced gene silencing in plants ( 1998) Plant J ， 16 ， 651 659 . • Giovanna Mason， Paolo Provero， Anna Maria Vaira， Gian Paolo Accotto. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR. (2002) BMC Biotechnol 2 (1)， 20 • P Song， C Q Ca， M. Skokut， B D Kosegi， J F Petolino. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimatingtransgene copy number in WHISKERS?-derived transgenic maize. (2002) Plant Cell Rep 20， 948–954

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