老年神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥(AD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、Ⅱ型糖尿病等，目前困擾著全世界大約5億人，且這個(gè)數(shù)字仍在不斷迅速增長(zhǎng)。尤其是阿爾茲海默癥（占70%以上），目前仍未有行之有效的診斷方法，因此無(wú)法得到有效的ZL或預(yù)防。盡管當(dāng)代病理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)這種病理變化與具有神經(jīng)毒性的β淀粉樣蛋白質(zhì)的聚集有關(guān)，但其在神經(jīng)元或腦組織中的聚集機(jī)制目前尚不清楚?，F(xiàn)有的方法, 如電子顯微鏡、免疫電子顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、超分辨顯微鏡，通常都需要對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)加工（標(biāo)記染色等）,可能會(huì)對(duì)淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)本身造成影響。而非標(biāo)記方法，如表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）, 前者受限于亞細(xì)胞水平上的低信噪比、自發(fā)熒光及不可逆的光損傷，后者其空間分辨率受限于紅外光波長(zhǎng)（≈5–10 μm），且光譜可解譯性和準(zhǔn)確性受到彈性細(xì)胞光散射所產(chǎn)生的米氏散射效應(yīng)(Mie scattering effects)的嚴(yán)重影響，使得直接在亞微米尺度上研究淀粉樣蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)的聚集行為十分困難。

    美國(guó)Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開(kāi)發(fā)的全新非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage， 是基于獨(dú) 家ZL的光學(xué)光熱誘導(dǎo)共振（O-PTIR）技術(shù)，它克服了傳統(tǒng)FTIR技術(shù)的衍射極限和米氏散射效應(yīng)，紅外光譜空間分辨率高達(dá)500 nm，且無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記, 不再需要衰減全反射（ATR）技術(shù)進(jìn)行厚樣品測(cè)試，且能夠無(wú)接觸和無(wú)損探測(cè)樣品，全程對(duì)樣品無(wú)污染，可以幫助科研人員更全面地了解亞微米尺度下樣品表面微小區(qū)域的化學(xué)信息，使得在亞細(xì)胞水平揭示生物分子結(jié)構(gòu)成為了可能。美國(guó)Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開(kāi)發(fā)的全新非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage（如圖1A所示），使用可見(jiàn)探測(cè)束（532 nm）來(lái)測(cè)量樣品在脈沖紅外光束照射下的紅外光熱響應(yīng)，具體體現(xiàn)為樣品反射率的變化，由于使用了可見(jiàn)光作為檢測(cè)光，使得其空間分辨率不再依賴于入射紅外光的波長(zhǎng)，且單一特定探測(cè)光束的使用還可以消除米氏散射效應(yīng)。

圖1. (A) 美國(guó)PSC公司非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage實(shí)物圖；（B）亞微米紅外成像示意圖：神經(jīng)元樹(shù)突的AFM形貌圖,其中神經(jīng)元直接在CaF2基底下生長(zhǎng)。mIRage采用兩束共線性光束: 532 nm可見(jiàn)(綠色)提取光束和脈沖紅外(紅色)探測(cè)光束，樣品的光熱響應(yīng)被檢測(cè)為樣品由于對(duì)脈沖紅外光束的吸收而引發(fā)的綠色光部分強(qiáng)度的損失，使紅外檢測(cè)的空間分辨率提高到≈500 nm. (C) 小鼠大腦皮層初級(jí)神經(jīng)元, 在CamKII促進(jìn)下表達(dá)為tdTomato熒光蛋白，使得神經(jīng)元結(jié)構(gòu)填滿紅色，圖片標(biāo)尺為20 μm。(D) 圖C區(qū)域放大圖片，箭頭指示樹(shù)突上的神經(jīng)元刺。

    因?yàn)樯鲜龅木薮蠹夹g(shù)優(yōu)勢(shì)和突破，非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage在生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)有廣泛的應(yīng)用前景和潛力，可應(yīng)用于諸如細(xì)胞學(xué)研究（蛋白質(zhì)、磷脂結(jié)構(gòu)分析，紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞成像等），臨床致病菌/病原微生物鑒定，癌癥診斷（細(xì)胞/組織），牙科/骨病變/眼科檢測(cè)，生物大分子損傷，生物組織識(shí)別，以及生物藥物檢測(cè)，法醫(yī)學(xué)等。

    近日，瑞典隆德大學(xué)的Klementieva教授團(tuán)隊(duì)與美國(guó)PSC公司的Mustafa Kansiz博士合作，使用全新非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)在亞微米尺度上研究了淀粉樣蛋白沿著神經(jīng)突直到樹(shù)突棘的聚集行為（圖1B和C），這是以往的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段所不可能實(shí)現(xiàn)的。在該研究中，他們使用了大腦皮層初級(jí)神經(jīng)元，這是因?yàn)樗鼈円装l(fā)生AD病變，且具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。初級(jí)神經(jīng)元的這種形態(tài)特征使得可以在單個(gè)神經(jīng)元層面上來(lái)測(cè)試全新非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)的分辨率和準(zhǔn)確性。首先，他們?cè)诜瓷淠Ｊ较芦@得了高質(zhì)量的紅外光譜，且不受米氏散射或基線失真等人為因素的干擾(圖2A,B)。值得注意的是，全新非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)其約為400 nm的橫向分辨率，使得他們能夠通過(guò)比較1740 cm-1處的峰強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)脂質(zhì)含量的差異，以及通過(guò)對(duì)比酰胺II (1540 cm?1)與酰胺I特征峰強(qiáng)度(1654 cm?1)的比值來(lái)比較氨基酸(蛋白質(zhì))的種類和數(shù)量上的差異(圖2C,D)。這是科學(xué)家們首次獲取單個(gè)樹(shù)突棘的高分辨率的化學(xué)圖像和紅外光譜，以往其它測(cè)試方法是無(wú)法做到的。

圖2. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage觀察初級(jí)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。 (A) 在1650 cm-1處獲得的神經(jīng)元的紅外圖像，顯示了蛋白質(zhì)的分布; (B)中對(duì)應(yīng)原始紅外光譜的位置用數(shù)字和圓點(diǎn)表示，圖片標(biāo)尺為20 μm；（C）在1650 cm-1處獲得的樹(shù)突的紅外圖像，數(shù)字表示D圖中獲得光譜的位置，圖片中標(biāo)尺為20 μm；（D）在C圖中兩點(diǎn)處取的歸一化紅外光譜,體現(xiàn)了該方法的亞微米空間分辨率。紅色箭頭表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化。

    為了在亞細(xì)胞層面上定位神經(jīng)元中β片層結(jié)構(gòu)，作者對(duì)APP-KO神經(jīng)元進(jìn)行了為時(shí)半小時(shí)的合成Aβ(1-42)處理（2×10?6 M），并使用非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)的成像分析（圖3A）。對(duì)Aβ處理后的APP-KO神經(jīng)元的紅外光譜進(jìn)行分析證實(shí)，β片層結(jié)構(gòu)可以在亞細(xì)胞水平上進(jìn)行分辨。有趣的是,純Aβ(1-42)纖維在1625 cm?1位置處有特征的紅外峰，當(dāng)加入到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)中后，β片層結(jié)構(gòu)的特征峰移動(dòng)到1630 cm-1處，表明淀粉樣原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，可能是由于其與細(xì)胞蛋白和/或細(xì)胞膜發(fā)生相互作用導(dǎo)致的（圖3B, C）。基于該發(fā)現(xiàn)，我們可以得出，在神經(jīng)元中的淀粉樣蛋白的構(gòu)型變化可能會(huì)引發(fā)阿爾茨海默癥進(jìn)程中的不同機(jī)制。為進(jìn)一步了解其形成機(jī)制，更多的方法學(xué)研究變得更加必要，如將非接觸式亞微米分辨紅外與免疫熒光顯微鏡結(jié)合起來(lái)，這種多模態(tài)成像模式可以在不同的細(xì)胞層面上更詳細(xì)分析特征蛋白的結(jié)構(gòu)變化，如前突觸或后突觸，囊泡(溶酶體或內(nèi)溶酶體)或其他細(xì)胞器。

圖3. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)Mirage觀察β片結(jié)構(gòu)在處理后的初級(jí)神經(jīng)元中的聚集行為。（A，B）APP-KO初級(jí)神經(jīng)元在1650和1630 cm-1處的明場(chǎng)和光熱紅外成像，彩色標(biāo)度表示光熱振幅的強(qiáng)度，從Z小值(藍(lán)色)到Z大值(紅色)，閾值為50%(以0為ZX)，插圖為放大或疊加后的紅外成像圖，圖片標(biāo)尺為20 μm；（C）神經(jīng)元中淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)在2×10?6 M Aβ(1-42) (紅色)處理或不處理(綠色)后分別對(duì)應(yīng)的紅外光譜。β片結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的特征紅外峰用紅色箭頭表示，光譜數(shù)據(jù)點(diǎn)間距為2 cm?1，數(shù)據(jù)進(jìn)行50次均一化處理。

    綜上所述，借助全新非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage，科學(xué)家成功首次揭示了初級(jí)神經(jīng)元的分子結(jié)構(gòu)，無(wú)需標(biāo)記，且因?yàn)樵摷夹g(shù)是在非接觸模式下工作，不會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成損傷，這在研究脆弱或粘性的物質(zhì)時(shí)顯得尤為重要。另外，該技術(shù)還能獲得亞微米尺度的紅外光譜，且不含由于背景失真或米氏散射造成的散射偽影。Z新的技術(shù)進(jìn)步表明，全新的非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)mIRage現(xiàn)在可以用來(lái)做活細(xì)胞成像,并保持相同的亞微米空間分辨率。在這種情況下，全新的非接觸式亞微米分辨紅外測(cè)量系統(tǒng)有望在β片層結(jié)構(gòu)在活神經(jīng)元的突觸附近的化學(xué)成像中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并提供一個(gè)新的機(jī)會(huì)來(lái)研究神經(jīng)毒性淀粉樣蛋白如何從一個(gè)患病的神經(jīng)元傳播到一個(gè)健康的神經(jīng)元，揭示阿爾茨海默癥的形成和發(fā)展機(jī)制。該工作發(fā)表在2020年的Advanced Sciences上（DOI: 10.1002/advs.201903004）。

在高內(nèi)相乳液(HIPE)中，初始離散單元在聚合過(guò)程中或之后轉(zhuǎn)變成由窗口高度互聯(lián)聚合體的時(shí)間和方式，一直是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題。其中，以苯乙烯/二乙烯苯作為油相的油包水高內(nèi)相乳液，是該領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)體系。在誘導(dǎo)聚合過(guò)程中，以支化的聚乙烯亞胺(PEI)為親水端和聚苯乙烯(PS)鏈作為疏水端。這類大孔表面活性劑可以在大劑量范圍內(nèi)穩(wěn)定HIPE并導(dǎo)致不同的開(kāi)孔多聚形態(tài)。然而由于受到表征技術(shù)的限制，原位探測(cè)上述過(guò)程詳細(xì)的機(jī)理仍然較為困難。

Photothermal Spectroscopy Corp研發(fā)的光學(xué)光熱紅外(optical photothermal infrared)表面成像新技術(shù)可適用于液體環(huán)境測(cè)試，為探索polyHIPE的窗口形成機(jī)理提供了機(jī)會(huì)。光學(xué)光熱紅外技術(shù)通過(guò)探測(cè)紅外光被吸收后所誘導(dǎo)的熱響應(yīng)信號(hào)來(lái)測(cè)試待測(cè)樣品的紅外振動(dòng)峰，該技術(shù)有四大優(yōu)勢(shì)：使用可見(jiàn)光為檢測(cè)光，可以將分辨率提高到 ~ 500 nm；非接觸式的光學(xué)顯微鏡；分辨率不依賴于紅外光波長(zhǎng)；不會(huì)產(chǎn)生彌散的偽影。有鑒于此，同濟(jì)大學(xué)萬(wàn)德成教授課題組與Photothermal Spectroscopy Corp合作，利用基于光學(xué)光熱紅外技術(shù)（O-PTIR）技術(shù)的非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage（圖1）對(duì)polyHIPE的聚合體進(jìn)行了紅外光譜和成像分析，探究其演變過(guò)程及形成機(jī)理。

圖1. A) 3%表面活性劑用量誘導(dǎo)的polyHIPE選取區(qū)域的光學(xué)照片，B)相應(yīng)的mIRage圖（條件: 紅色代表強(qiáng)烈的反應(yīng)，綠色代表幾乎沒(méi)有反應(yīng)，而黃色代表對(duì)1492 cm-1處的激光束的中等反應(yīng)），C)插圖為典型的選定區(qū)域附近的局部表面形貌(通過(guò)SEM)，D) 插圖為立方狀樣品的光學(xué)照片(≈5×5×5 cm3)

如圖1B所示，PS對(duì)在1492 cm-1處激光束有紅外響應(yīng)，對(duì)新鮮的多聚體表面進(jìn)行該波長(zhǎng)激光掃描，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)有代表性的區(qū)域。區(qū)域1幾乎沒(méi)有PS信號(hào)，說(shuō)明表面完全覆蓋 PEI 大孔表面活性劑, 對(duì)其他組成不太敏感 , 區(qū)域3顯示 一 個(gè) 強(qiáng)烈紅外信號(hào),對(duì)應(yīng) PS 塊體人工樣品處理后的橫截面。區(qū)域2呈現(xiàn)出島狀的PS微區(qū)，點(diǎn)綴在大孔表面活性劑覆蓋的表面。由此推斷，PS微區(qū)可能起源于相分離誘導(dǎo)的大孔表面活性劑的析出。

圖2. 在1600 (綠色)和1492 cm-1(紅色)激光束照射下的多聚體表面的mIRage 2D O-PTIR圖像。B)一系列的FTIR光譜提取采樣點(diǎn)(箭頭尾)。每個(gè)采樣點(diǎn)的高度比為1600/1492 cm-1，如(C)所示，相鄰的采樣點(diǎn)為250 nm

進(jìn)一步對(duì)區(qū)域2進(jìn)行1600和1492 cm-1位置逐點(diǎn)熱成像掃描得到二維圖像(圖2A)，可以觀察到一個(gè)不均勻的表面，表明發(fā)生了相分離。1600和1492 cm-1的波長(zhǎng)分別用綠色和紅色表示，PS對(duì)1600和1492 cm-1的激光束均有紅外響應(yīng), PEI也對(duì)1600 cm-1的激光束有紅外響。因此，如果表面僅僅是由PS決定的，那么1600和1492 cm-1的強(qiáng)度比應(yīng)該不發(fā)生變化。1600/1492 cm-1紅外強(qiáng)度比分布圖(圖2C)以及線性點(diǎn)提取紅外光譜(圖2B)都可以顯示目標(biāo)位置的表面化學(xué)成分，證實(shí)了相分離的發(fā)生。

綜上所示，非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage為polyHIPE表面相分離的存在提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，有助于未來(lái)窗口的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]. C. H. Li, M. Jin, D.C. Wan, Evolution of a Radical-Triggered Polymerizing High Internal Phase Emulsion into an Open-Cellular Monolith, Macromol. Chem. Phys. 2019, 220, 1900216.

    低能量邊緣光致發(fā)光的研究對(duì)提高Ruddlesden-Popper鈣鈦礦太陽(yáng)能電池效率有著十分重要的影響和意義。然而對(duì)其機(jī)制的研究卻一直面臨著巨大挑戰(zhàn)：（1）材料的結(jié)構(gòu)難以確定；（2）理論模型與觀測(cè)結(jié)果始終不一致。因此，尋找可靠、有效的表征手段對(duì)于揭示相關(guān)機(jī)制有著至關(guān)重要的意義。

    紅外光譜對(duì)于有機(jī)物的變化十分敏感，在有效探知電池材料的分布變化方面具有天然的優(yōu)勢(shì)。近期，Photothermal Spectroscopy Corp公司研發(fā)推出的新一代的非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)-mIRage在此研究中脫穎而出，該技術(shù)采用激光探針，能夠?qū)悠返谋砻鎸?shí)行非接觸式光熱紅外探測(cè)，具備亞微米的空間分辨率并且無(wú)邊緣散射問(wèn)題。

    近日，電子科技大學(xué)王志明教授課題組與Photothermal Spectroscopy Corp公司合作，使用新一代的非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)-mIRage研究MAPbBr₃在(BA)₂(MA)₂Pb₃Br板邊緣的分布情況。在此項(xiàng)研究中，所測(cè)試的(BA)₂(MA)₂Pb₃Br₁₀和MAPbBr₃之間缺少BA，使其紅外光譜有顯著差異；同時(shí)無(wú)論是BA缺陷，還是BA對(duì)MA的比例都已有使用FTIR光譜研究的報(bào)道，因此具備良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。進(jìn)一步使用O-PTIR技術(shù)進(jìn)行非接觸式探測(cè)，有效避免了樣品高度，探針污染所帶來(lái)的問(wèn)題，使得結(jié)果更加jing準(zhǔn)。

    通過(guò)使用mIRage的測(cè)量（圖1），能夠觀測(cè)到隨著B(niǎo)A含量的降低，~1580 cm^-1處的峰相對(duì)強(qiáng)度減小，峰值伴隨著向1585 cm^-1的峰值偏移。這主要是由于(BA)₂(MA)₂Pb₃Br₁₀在1580 cm^-1附近有兩個(gè)涉及NH₃振動(dòng)的紅外吸收帶:分別為1575 cm^-1處(BA⁺)和1585 cm^-1處(MA⁺)。當(dāng)BA含量降低時(shí)，1575 cm^-1處的帶強(qiáng)度降低，導(dǎo)致峰值強(qiáng)度在約1580 cm^-1處降低，并伴隨向1585 cm^-1偏移。在測(cè)試中觀測(cè)到的另外一個(gè)現(xiàn)象為~1480 cm^-1與~1580 cm^-1的相對(duì)強(qiáng)度比增大，這是由于1478 cm^-1的振動(dòng)(CH₃振動(dòng))僅與MA⁺相關(guān)，因此~1480 cm^-1的強(qiáng)度沒(méi)有變化，而1580 cm^-1卻由于BA含量降低而降低，導(dǎo)致比值的降低。上述結(jié)果清晰地顯示了MAPbBr₃在(BA)₂(MA)2Pb3Br板邊緣的組成分布情況。由此可見(jiàn)，mIRage 的O-PTIR技術(shù)在電池低能量邊緣光致發(fā)光的研究中有十分理想的效果，極具應(yīng)用前景。

圖1. O-PTIR觀測(cè)邊緣的MAPbBr₃的紅外光譜信息。(a)(BA)₂(MA)_n-1 bn br_3n+1(n = 1，2，3，∞)鈣鈦礦的紅外光譜。（b-c）(BA)₂(MA)₂Pb₃Br₁₀和MAPbBr₃的中MA⁺分子在1480 cm^-1 (b)和BA⁺分子 1580 cm^-1 (c)的圖譜；(d) (BA)₂(MA)₂Pb₃Br₁₀的PL圖像。(e)在(d)中所示的ZX區(qū)域和邊緣的紅外光譜圖

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhaojun Qin, Shenyu Dai et al., Spontaneous Formation of 2D/3D Heterostructures on the Edges of 2D Ruddlesden-Popper Hybrid Perovskite Crystals, Chemistry of Materials, DOI: 10.1021/acs.chemmater.0c00419.