elisa出現(xiàn)全板空白的原因

　　ELISA實驗中出現(xiàn)全板空白的原因主要包括以下幾個方面：

　　試劑問題：試劑盒在運輸、保存期間放置的溫度過高，時間過長，導致抗原、抗體效價下降，酶的活力降低;試劑盒已經(jīng)超出保存的有效期，抗原抗體效價下降，酶的活性降低。?

　　操作問題：漏加或者誤加試劑，如忘記加酶、忘記加顯色液、酶或顯色液污染失效等。?

　　樣本問題：樣本存在內(nèi)源性干擾物質(zhì)，樣本溶血、貯存過久、凝集不全、被細菌污染等。?

　　設備問題：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶物;洗滌液配制有誤等。具體原因分析：

　　試劑問題：試劑盒在運輸、保存期間放置的溫度過高，時間過長，導致抗原、抗體效價下降，酶的活力降低;試劑盒已經(jīng)超出保存的有效期，抗原抗體效價下降，酶的活性降低。

　　操作問題：漏加或者誤加試劑，如忘記加酶、忘記加顯色液、酶或顯色液污染失效等。

　　樣本問題：樣本存在內(nèi)源性干擾物質(zhì)，樣本溶血、貯存過久、凝集不全、被細菌污染等。設備問題：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物;洗滌液配制有誤等。

　　解決方法：

　　檢查試劑：確保試劑在有效期內(nèi)使用，避免高溫存放;檢查試劑是否有過期或失效的情況。?13規(guī)范操作：嚴格按照操作規(guī)程進行，避免漏加或誤加試劑;每次加液前核對標簽，確保無誤。

　　處理樣本：避免樣本溶血、污染、過久儲存等現(xiàn)象;檢查樣本中是否存在內(nèi)源性干擾物質(zhì)。

　　設備檢查：使用干凈的器皿配制試劑，確保洗滌液正確配制;校正溫育箱溫度，確保溫育時間和溫度足夠。

空白和樣品的數(shù)據(jù)處理

第一種：我是用樣品檢測值減去空白的檢測值，然后帶入國標公式計算

第二種：我分別把空白檢測值和樣品檢測值帶入國標公式，算出結(jié)果后，再進行相減

理論上這兩種結(jié)果都是一樣的，但是我想了解應該是用哪一種呢？

矩形色塊

在日常檢測分析中，鉛是一個幾乎必檢的項目。稱取樣品加入適量的硝酸，同時做空白試驗，經(jīng)過濕法消解或微波消解定容后上機檢測。很多檢驗員會發(fā)現(xiàn)一個問題，樣品的空白值要遠遠大于樣品的測試值，甚至超過很多倍，有時候大得驚人，達到了近1ppb或者更高，由此計算所得出的樣品中鉛的含量為未檢出。樣品空白值這個謎一般的存在，到底是什么造成的呢？尋其原因，大部分檢驗員會從以下幾方面來進行分析

大部分實驗室選擇用原子吸收進行檢測，原子吸收受到各種因素的影響會對檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差。

1）石墨爐需檢查進樣針是否污染、石墨管是否污染損壞等。及時清洗進樣針，空燒或者更換石墨管。

2）火焰需檢查燃燒頭進樣針是否有殘留污染。用硬卡片將燃燒頭清理干凈，進5%硝酸空燒清洗。

按照上述操作后，如果結(jié)果并沒有改變，建議更換設備使用ICP-MS進行測試，如果試劑空白檢測結(jié)果正常，則繼續(xù)進行上面的操作進行設備的清潔，如果檢測結(jié)果和原子吸收檢測結(jié)果是一樣的，那就可以說明試劑空白是有問題的。

檢查空白試劑

純水、硝酸本底是否偏高。將濃硝酸用純水稀釋到2%，連同純水一同進樣。通過結(jié)果進行判斷。

容器是否有殘留

鉛殘留是很普遍的現(xiàn)象，重金屬檢測中，容器的清洗尤為關(guān)鍵，三步走是必須的，一洗二泡三沖?？梢哉f重金屬檢測是另類的“微生物”檢測，一點點的殘留，經(jīng)日積月累后是很難消除的。

注：對于很多機構(gòu)來說，微波消解是最常使用的前處理設備，因為消解管比較昂貴，這對于大部分機構(gòu)來說都是一筆不小的費用。如果消解管受到污染不適合做低含量的樣品，并且當酸泡已經(jīng)無法解決問題，需要靠無限的空燒來降低殘留干擾，這又會大大縮短消解管的壽命。日常檢測推薦使用快速石墨消解，并使用一次性離心管，這樣既可以減少污染又可以節(jié)約成本，還能保證數(shù)據(jù)的準確。

如果上述3步都檢查完畢，確認沒有問題，但是樣品的空白值依然不減。怎么辦？很多實驗員為此抓狂。

其實，很多人都忽略了一個更重要的因素！

環(huán)境因素！環(huán)境因素！環(huán)境因素！

前文提及，重金屬檢測堪比“微生物”檢測，最怕受到污染，對整個實驗環(huán)境要求很高。因此，應采用獨立的前處理室、獨立使用的耗材、獨立的通風系統(tǒng)等。

樣品存放、處理等過程中不可以接觸金屬類耗材、容器的要求實驗人員基本都能做到，但是他們往往忽略了容器、耗材等存放過程中是否符合要求。如清洗好的消解管、容量瓶等放在金屬托盤、鐵皮柜或者合金架上，移液管、移液槍等暴露在灰塵空氣中，這些都會造成間接污染。除此之外，通風系統(tǒng)尤為關(guān)鍵，在消解趕酸時會產(chǎn)生酸蒸汽，室內(nèi)外溫差會導致通風櫥內(nèi)酸蒸汽冷凝回流，樣品在與酸的反應過程中會產(chǎn)生更多的酸蒸汽堆積在管口，樣品空白因無反應，在通風櫥不潔凈的情況下更易受到環(huán)境的污染，致使樣品空白增大。這就是導致樣品空白鉛、含量遠超被測樣品的原因。

從人員、儀器、試劑等方面進行排查，不如先從最基礎(chǔ)的實驗室環(huán)境做起！

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原子熒光的標準空白和樣品空白的區(qū)別在哪里？

納氏試劑分光光度法測氨氮空白值偏高的原因探討

一、檢測原理

以游離態(tài)的氨或銨根離子等形式存在的氨氮與納氏試劑反應生成淡紅棕色絡合物，該絡合物的吸光度與氨氮含量成正比，于420nm波長處測量。

二、實驗步驟

三、線性空白值偏高的常見問題原因分析及解決方案

1、用1cm比色皿時的空白吸光度空白值偏高，大于0.030，導致線性不好或截距偏大。

原因分析：

(1)試劑純度（所用試劑含銨鹽，如酒石酸鉀鈉）；

(2)試驗用水被污染，引入氨或者銨鹽。

解決方案：

(1)用礦物質(zhì)穩(wěn)定劑代替酒石酸鉀鈉；

(2)在無氨條件下制水并密封儲存，或者使用高質(zhì)量新鮮的蒸餾水代替無氨水，并且在實驗前測試空白吸光度低于0.030方可使用。

2.顯色溫度的控制

冬季室溫往往較低，如室溫介于5-10℃時顯色會不完全；而溫度在20-25℃時顯色最完全且較穩(wěn)定；溫度超過30℃，顯色不穩(wěn)定且極易褪色，導致吸光度偏低。所以顯色溫度應控制在20-25℃之間。

3.顯色時間的控制

3.1  納氏反應時間小于10min，反應不充分；10-30min反應相對穩(wěn)定；30-45min顯色會相應加深；大于45min，顯色會處于減退狀態(tài)。因此應控制反應時間在10-30min。

3.2  顯色完全后應盡快測定，防止顏色加深或褪色影響吸光度。 

4.比色皿的尺寸選擇和吸附

4.1  根據(jù)樣品的濃度可以選擇10mm或者20mm的比色皿，選擇10mm比色皿時，空白吸光度應該小于0.03，相應地，選擇20mm比色皿時，空白吸光度應該小于0.06。

4.2  高濃度在比色皿中的吸附尤其明顯，可能導致測定結(jié)果偏高。盡量按濃度從低到高的順序測定，尤其是測標曲時；

4.3  為了準確測定，測樣前用蒸餾水沖洗比色皿3遍以上再測定，以減少吸附產(chǎn)生的誤差；

4.4  測定完成后，比色皿上壁上如仍有吸附物，應將比色皿放在鉻酸洗液或稀硝酸中浸泡片刻，再進行沖洗后備用。

5.顯色劑用量對測定結(jié)果的影響

表1  納氏試劑加入量(LV化汞)對空白值和2mg/L標液吸光度的影響

從表1可知，隨著納氏試劑加入量增大，空白值會變高。應按照國標方法要求加入合適體積的納氏試劑。

6.納氏試劑的使用與儲存

6.1納氏試劑使用前需恒溫至室溫，且使用前不可搖勻，應吸取上清液使用。納氏試劑在生產(chǎn)配制后也需靜置進行沉淀。

6.2納氏試劑的使用選擇，根據(jù)HJ 535-2009，市面上LV化汞和DIAN化汞兩種原料的納氏試劑均可使用，如圖1所示。

圖1  HJ 535-2009方法中對納氏試劑選擇的規(guī)定

6.3納氏試劑應冷藏避光保存。

文章來源：標準物質(zhì)ZX（https://www.gbw-china.com/)