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  田明888888 2017-10-04 06:51:47

  隨著膨化技術(shù)在飼料工業(yè)中推廣普及，越來(lái)越多的飼料生產(chǎn)商在配方中使用膨化大豆粉，與其它蛋白資源一樣，大豆的適度熟化非常重要，熟化程度低會(huì)含抗胰蛋白酶等營(yíng)養(yǎng)YZ因子，熟化度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致氨基酸利用率低。判斷膨化大豆粉是否合格的主要指標(biāo)是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的條件下，每分鐘每克膨化大豆分解尿素所釋放的氨態(tài)氮的毫克數(shù)。脲酶本身無(wú)營(yíng)養(yǎng)意義，但它與抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇熱變性失活的程度與抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用來(lái)作為膨化大豆加熱是否合適的間接估測(cè)指標(biāo)。脲酶活性沒(méi)有負(fù)值，Z低為0。在我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)推薦值為0.3，在美國(guó)一般認(rèn)為以不超過(guò)0.2為宜，并且針對(duì)日糧中有尿素的反芻動(dòng)物而言不得超過(guò)0.12，當(dāng)然對(duì)于家禽和豬0.3或稍高都可以接受。國(guó)內(nèi)很多大企業(yè)一般均采用0.2。 實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定脲酶活性的方法較復(fù)雜，有滴定法和pH增值法兩種，已有研究表明兩者對(duì)同一樣品測(cè)得的數(shù)值也不相等。目前國(guó)內(nèi)絕大部分企業(yè)都采用快速而簡(jiǎn)單的簡(jiǎn)易判定方法定性地估測(cè)脲酶活性，一般來(lái)說(shuō)，主要有如下兩種方法。 一.液態(tài)法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，會(huì)使酚紅指示劑改變顏色。 2.試劑 2.1尿素:GB696，分析純。 2.2酚紅指示劑 2.2.1稱取0.1g酚紅，加1.43mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在研缽中研磨以促溶解； 2.2.2轉(zhuǎn)移至250mL定量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻備用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末樣品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚紅指示劑2滴，再加水20mL，充分搖勻15s。 3.3記錄粉紅色出現(xiàn)時(shí)間，并根據(jù)時(shí)間判斷尿酶活性，顏色出現(xiàn)時(shí)間應(yīng)少于15min。 顏色出現(xiàn)時(shí)間 脲酶活性 1min 極強(qiáng) 1～5min 強(qiáng) 5～15min 稍有 15min 無(wú) 同時(shí)作空白對(duì)照試驗(yàn)。 樣品空白(不加尿素)及試劑空白(不加樣品)，只有上述空白正常時(shí)，即酚紅指示劑不改變顏色，試驗(yàn)結(jié)果才是可靠的。 一般企業(yè)認(rèn)為7、8分鐘變色較為合適。 二、半固態(tài)法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，會(huì)使酚紅指示劑改變顏色。 2.試劑 2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。 2.2尿素一酚紅試劑 2.2.1將1.2克酚紅溶解于30ml0.2N的NaOH中； 2.2.2用蒸餾水將之稀釋至約300mL； 2.2.3加入90g尿素（分析純）并溶解之； 2.2.4用蒸餾水稀釋至2L； 2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4； 2.2.6用蒸餾水稀釋至Z后體積3L； 2.2.7溶液應(yīng)具明亮的琥珀色。 3.操作方法 3.1在一個(gè)150ml的燒杯中倒入少量試劑，注意溶液必須呈明亮的琥珀色。若溶液已轉(zhuǎn)變?yōu)樯罱奂t色，滴人稀硫酸溶液并攪拌之，直至溶液再度呈琥珀色。 3.2量一匙粉末樣品，放置于培養(yǎng)皿中。 3.在樣品上加入兩匙試劑，輕輕攪拌，將樣品平鋪于培養(yǎng)皿中。若仍有干樣品斑點(diǎn)，則再加入試劑，直至將樣品浸濕。 4.放置5分鐘后觀察： a. 沒(méi)有任何紅點(diǎn)出現(xiàn)：再任其放置25分鐘，若仍無(wú)紅點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明大豆粉過(guò)熟。 b. 有少量紅點(diǎn)：少量尿素酶活性，可用。 c. 樣品表面約有25％為紅點(diǎn)覆蓋：少量尿素酶活性，可用。 d. 豆餅表面約有50％為紅點(diǎn)覆蓋：尿素酶活性較高，不可以使用。 e. 豆餅表面的75％－100％為紅點(diǎn)覆蓋：尿素酶活性很高，樣品過(guò)生，不能使用。 以上兩種簡(jiǎn)易脲酶活性估測(cè)方法在國(guó)內(nèi)各飼料廠被廣泛采用，尤其是后者在膨化大豆粉生產(chǎn)的在線檢測(cè)上很普遍。盡管這兩種方法原理一樣，但是，因其操作過(guò)程差異，所以對(duì)膨化大豆粉品質(zhì)的反映內(nèi)容也不盡相同。 三、液態(tài)法和半固態(tài)法之比較 首先需要說(shuō)明的是，這兩種脲酶活性快速檢測(cè)方法沒(méi)有行業(yè)約定俗成的名稱，筆者接觸過(guò)的企業(yè)均只采用其中的一種方法，對(duì)前者可以稱之為“試管法”，后者稱之為“表面皿法”，根據(jù)其實(shí)施的過(guò)程及樣品的狀態(tài)，筆者將其區(qū)分為“液態(tài)法”和“半固態(tài)法”。 從實(shí)施方法來(lái)看，液態(tài)法是過(guò)程檢測(cè)，從開始一直到規(guī)定時(shí)間段結(jié)束，而半固態(tài)法屬于斷點(diǎn)檢測(cè)，是5分鐘后看結(jié)果；液態(tài)法通過(guò)控制各個(gè)體合格，總體自然合格，而半固態(tài)法要求的是總體符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格，即允許部分個(gè)體不合格。簡(jiǎn)單地說(shuō)，液態(tài)法要求每一個(gè)微粒的熟化程度均要滿足5分鐘以內(nèi)不變色，如果一個(gè)不合格，整個(gè)批次為不合格；而半固態(tài)法允許部分微粒在5分鐘內(nèi)變色，部分不合格，總體可以是合格的。從這點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，液態(tài)法對(duì)膨化大豆粉的品質(zhì)要求更高，控制更嚴(yán)格，不僅要求熟化，而且要均勻熟化。舉例說(shuō)明，如果在熟化完全的大豆粉樣品中摻入微量（可以是一粒）生大豆粉，液態(tài)法會(huì)立即變色從而判定為不合格，而半固態(tài)法只是增加了一個(gè)變色點(diǎn)，總體上仍是合格的。 從上可以看出，這兩種檢測(cè)方法對(duì)膨化大豆粉品質(zhì)的反映內(nèi)容是不一樣的。半固態(tài)法反映的是產(chǎn)品符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格，而液態(tài)法反映的是完全合格。這兩種不同檢測(cè)方法對(duì)膨化設(shè)備的要求也是有差別的，液態(tài)法要求設(shè)備能均勻熟化，而半固態(tài)法允許產(chǎn)品出現(xiàn)部分不合格，只要總體上符合就可以，對(duì)膨化設(shè)備的要求自然要低。 可能會(huì)有人疑問(wèn)，膨化大豆粉出來(lái)的不都應(yīng)該是均勻一致的嗎？其實(shí)不然，物料在膨化機(jī)內(nèi)受到濕、熱、機(jī)械剪切的共同作用從而熟化，機(jī)械剪切對(duì)膨化大豆粉所起的作用大約能占三成多，如果結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上缺陷或部件磨損，就會(huì)導(dǎo)致熟化不均勻。目前濕法膨化大豆粉的出料溫度大都在135度左右（對(duì)家禽和豬要求可能低點(diǎn)），六年前，筆者曾遇到過(guò)膨化大豆粉出料溫度在170度，用液態(tài)法檢測(cè)仍不合格，出來(lái)的料有熟的，有褐變的，還有少許夾生的，如果用半固態(tài)法檢測(cè)，估計(jì)就合格了。次年，一膨化廠使用某企業(yè)膨化機(jī)生產(chǎn)膨化大豆粉，因不熟被退貨六十噸，根據(jù)大部分企業(yè)采用半固態(tài)法檢測(cè)的情況，將其以一定比例摻入熟化料中，Z終符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合格。上述事件，大概就是這兩種不同測(cè)定方法的實(shí)踐意義吧。 脲酶urease（水解酶）： 脲酶試驗(yàn)原理： 存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶、能酶促有機(jī)物質(zhì)分子中酶鍵的水解。脲酶的作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的Z終產(chǎn)物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和SX磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。 土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法是測(cè)定生成的氨量。 試劑：1）甲苯 2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml。 3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184克檸檬酸和147.5克氫氧化鉀溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋至1000毫升。 4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀釋至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。將AB溶液保存在冰箱中。使用前將2溶液各20毫升混合，用蒸餾水稀釋至100毫升。 5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。 6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：a 精確稱取0.4717克硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀釋了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘，用水稀釋至刻度。將著色液在紫外分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。 取新鮮土壤7份，每份30g，裝于棕色廣口瓶中，先將1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分別加入不同濃度均為1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的濃度分別為1、10、50、100、200、500µg/g，另1份相應(yīng)加入1.5ml的丙酮作為對(duì)照，然后調(diào)節(jié)土壤的含水量至Z大田間持水量的60%（記錄此時(shí)重量，以便補(bǔ)充水分）。放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后來(lái)測(cè)定的敞口）、20d，30d，40d，50d分別取土樣檢測(cè)脲酶的活性。取樣前，反復(fù)旋轉(zhuǎn)廣口瓶，混勻土樣，一個(gè)處理隨機(jī)取3個(gè)重復(fù)。 1) 稱取5g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣于100ml容量瓶中。 2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土樣濕潤(rùn)為度）并放置15分鐘 3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml檸檬酸緩沖液（PH6.7），并 仔細(xì)混合 4) 將容量瓶放入37攝氏度恒溫箱中，培養(yǎng)24h 5) 培養(yǎng)結(jié)束后，用熱至38攝氏度水稀釋至刻度，仔細(xì)搖蕩，并將懸液用致密濾紙過(guò)濾于三角瓶中。 6) 顯色：吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸餾水，充分震蕩，然后加入4ml苯酚鈉，仔細(xì)混合，再加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘，用水稀釋至刻度，溶液呈現(xiàn)（青定）酚的藍(lán)色。 7) 1h內(nèi)在（（青定）酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計(jì)上用1cm液槽，于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測(cè)定。 8) 無(wú)土對(duì)照：不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。以檢驗(yàn)試劑純度，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對(duì)照 9)無(wú)基質(zhì)對(duì)照：以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。每個(gè)土樣都設(shè)此對(duì)照。 結(jié)果計(jì)算：土壤脲酶活性以24小時(shí)后100g土壤中NH3－N的毫克數(shù)表示。 M＝（X樣品－X無(wú)土－X無(wú)基質(zhì)）*100*10 式中：M－土壤脲酶活性值 X樣品――樣品實(shí)驗(yàn)的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù) X無(wú)土――無(wú)土對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù) X無(wú)基質(zhì)――無(wú)基質(zhì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù) 100 ――樣品定容的體積與測(cè)定時(shí)吸取量的比值 10 ――酶活性單位的土重與樣品土重之比值 注意事項(xiàng)：當(dāng)脲酶活性為3-80微克NH3-N時(shí)，本法能獲得可靠結(jié)果。當(dāng)脲酶活性小于3微克NH3-N，培養(yǎng)時(shí)間需增至24小時(shí)（已經(jīng)24h了）（計(jì)算時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)） 計(jì)算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示。 NH3-N（mg）＝a*2 A：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得NH3-N毫克數(shù) 2 ：換算成1k土的系數(shù)。

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