導讀

表皮屏障是通過角質(zhì)形成細胞的干細胞的激活、增殖和分化而恢復的，但其在損傷和老化后通過不明確的機制阻礙了這一修復過程。作者在之前發(fā)現(xiàn)了老年小鼠表皮代謝功能障礙的基因特征，但表皮修復和年齡相關(guān)生長缺陷的精確調(diào)控機制尚未建立。所以作者使用衰老小鼠模型以及代謝調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔激活物-1α（Pgc-1α）有條件表皮缺失的小鼠，探索控制損傷和應激后皮膚修復的細胞途徑。

美國東北大學生物系與加拿大渥太華大學生物化學、微生物學和免疫學系聯(lián)合研究的研究人員在Molecular Metabolism雜志上發(fā)表了題為《Pgc-1α controls epidermal stem cell fate and skin repair by sustaining NAD homeostasis during aging》的文章。文中的H&E染色結(jié)果和免疫熒光結(jié)果均應用Echo Revolve 顯微鏡進行顯微成像。

研究亮點：

通過ECHO Revolve顯微鏡對染色的外植體和免疫熒光結(jié)果進行成像，得到分辨率高，細節(jié)清晰的圖像，并結(jié)合其他結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)：

?   衰老延緩小鼠傷口再上皮化，與Pgc-1α信號轉(zhuǎn)導降低相關(guān)。

?  表皮Pgc-1α的缺失減緩了愈合，并由于NAD穩(wěn)態(tài)的破壞而減少了增殖。

? 低水平的表皮NAD會增強p53生長停滯，但在補充NAD后會逆轉(zhuǎn)。

? 衰老會破壞表皮NAD穩(wěn)態(tài)，但NAD前體可逆轉(zhuǎn)表皮生長缺陷。

文中所有的H&E染色和免疫熒光結(jié)果均是使用Echo Revolve Generation 2顯微鏡進行的快速清晰的成像。揭示了衰老會損傷傷口愈合過程中的表皮再生長，并導致Pgc-1α的表達降低。表皮Pgc-1α有條件缺失的小鼠表現(xiàn)出更大的炎癥和UVB誘導的細胞分化、減少的增殖和較慢的傷口愈合。epiPgc-1αKO小鼠還表現(xiàn)出角質(zhì)形成細胞NAD水平降低、端?？s短和多聚ADP核糖化增加，導致應激刺激的p53和p21信號增強。當NAD因Pgc-1α缺失或NAD合成的藥理學抑制而減少時，應激誘導的增殖減少，分化增加，并通過表皮脫落增強保護DNA免受損傷。同樣，老年小鼠表現(xiàn)出表皮NAD穩(wěn)態(tài)紊亂和p53活化增強，導致?lián)p傷后p21生長停滯。NAD前體治療可恢復老年皮膚到年輕皮膚的表皮生長狀態(tài)。

研究成果：

▼圖1證明了與年齡相關(guān)的傷口愈合和表皮生長障礙與Pgc-1α信號傳導減少有關(guān)。

▲ 圖1.衰老導致傷口愈合較慢，表皮干細胞生長受損，與Pgc-1α信號傳導減少相關(guān)。（A）損傷后9天內(nèi)的傷口閉合（右側(cè)第9天圖像）和（B）年輕（4月齡）和老年（24月齡）C57 / Bl6小鼠的角質(zhì)形成細胞生長。使用結(jié)晶紫對（B）中的細胞生長進行染色以便于觀察。（C）表皮層分層及其標志物的圖解。（D）傷口損傷后5天，年輕和老年皮膚中角質(zhì)蛋白-14陽性表皮舌的平均長度。（E）損傷后5天，年輕和老年小鼠愈合傷口基礎表皮前緣右側(cè)的EdU細胞。（F）年輕和老年小鼠傷口表皮的代表性圖像。（G）年輕和老年小鼠表皮中Pgc-1α和Pgc-1β mRNA的qPCR數(shù)據(jù)。（H）與對照相比，急性UVB暴露后24和48小時，年輕小鼠的表皮Pgc-1α mRNA的表達量。

▼圖2證明了表皮Pgc-1α的缺失可減少應激誘導的增殖，增強分化并導致傷口愈合緩慢。

▲ 圖2.表皮Pgc-1α的遺傳缺失在生理性皮膚損傷后減少細胞生長并增強分化。（A）角質(zhì)形成細胞中cre-lox重組以刪除Pgc-1α的示意圖。（B）7–9 WT和epiPgc-1αKO小鼠的表皮Pgc-1β mRNA（Ppargc1a）。（C）角蛋白14（K14）、角蛋白10（K10）和loricrin（Lor）的代表性圖像。（D）UVB誘導WT和epiPgc-1αKO小鼠中EdU表皮細胞和（E）K10層厚度相對于對照皮膚的折疊變化。（F）UVB暴露表皮中γH2AX和胸腺嘧啶二聚體的定量，右側(cè)為5 WT和epiPgc-1αKO小鼠的代表性圖像。（G）TPA誘導WT和epiPgc-1αKO小鼠EdU表皮細胞和（H）K10層增厚相對于對照皮膚的折疊變化。（I）7–8 WT和epiPgc-1αKO小鼠9天后的開放傷口面積。

▼圖3表明Pgc-1α維持表皮NAD穩(wěn)態(tài)，NAD挽救的藥理學抑制促進UVB誘導的分化并防止DNA損傷。

▲ 圖3.Pgc-1α缺失的角質(zhì)形成細胞破壞了NAD代謝，對NAD合成的藥物抑制足以減少增殖并增強UVB誘導的分化。（A）7–9 WT和epiPgc-1α KO小鼠表皮NAD代謝相關(guān)基因的mRNA相對表達。（B）4–5只WT和epiPgc-1α KO小鼠尾部表皮中NAD的相對水平。（C）72小時后，來自年輕皮膚外植體的體外角質(zhì)形成細胞生長對Nampt抑制劑FK866的劑量反應。（D）C57 / Bl6小鼠中FK866應用與UVB應激相結(jié)合的示意圖。（E） 對照手術(shù)或UVB暴露48小時后，用局部FK866（100 nM）或載體（Veh；乙醇）處理的每組5–6只小鼠的表皮NAD水平。（F）角蛋白10層級增厚。（G）表皮增殖（EdU）的變化，以及（H）γH2AX陽性表皮細胞的豐度。代表性免疫熒光圖像（F–H）顯示在量化右側(cè)。

▼圖4證明了增加Pgc-1a缺失小鼠的NAD水平挽救異常應激誘導的分化并恢復傷口愈合。

▲ 圖4.用NAD前體治療表皮Pgc-1αKO小鼠可加速皮膚愈合并抑制UVB誘導的分化。（A–B）使用4 WT和epiPgc-1αKO皮膚樣品（NAD前體煙酰胺單核苷酸（NMN）、煙酰胺（NAM）或煙酰胺核苷（NR）處理或未處理），角質(zhì)形成細胞生長為外植體面積的一部分或載體條件的數(shù)倍。（C）（A–B）生長出的代表性圖像用結(jié)晶紫染色，以便于可視化。（D–F）每天注射賦形劑或500 mg/kg NR的4-7 WT和epiPgc-1αKO小鼠的肝臟NAD、尾表皮NAD水平和傷口完全閉合的時間。損傷后第0天（D0）、第11天（D11）和第13天（D13）的代表性圖像。（G） UVB暴露和NR劑量示意圖。（H–K）用載體或煙酰胺核苷（NR）處理的4只WT和Pgc-1αKO小鼠的UVB暴露表皮中的角蛋白10增厚、γH2AX細胞和胸腺嘧啶二聚體細胞。代表性免疫熒光圖像及量化結(jié)果。

▼圖5證實了Pgc-1α的缺失誘導端粒縮短，增強Parp活性并增強應激誘導的p53信號傳導。

▲ 圖5.表皮Pgc-1α缺失后的端粒功能障礙以NAD依賴的方式使干細胞對應激誘導的p53活化和核增大敏感。（A）定量6–7 WT和epiPgc-1αKO小鼠表皮裂解物中多聚和單ADP核糖（MAR/PAR）的免疫印跡。（B）4–6 WT和epiPgc-1αKO小鼠的亮染MAR/PAR表皮細胞數(shù)量（MAR/PAR+高）。（C）表皮裂解液中泛乙酰賴氨酸的免疫印跡定量。（D）平均表皮端粒長度。（E）5–6 WT和epiPgc-1αKO小鼠的載體和TPA處理皮膚中的核HMGB1細胞和（F）基底層核大小。（G）用載體或煙酰胺核苷（NR，500 mg/kg）處理的WT和epiPgc-1αKO小鼠58小時后，UVB暴露表皮的核HMGB1或（H）p21表皮細胞以及（I）基底層核大小。（J）用局部載體或FK866處理的6只C57Bl/6小鼠中，對照手術(shù)和UVB暴露表皮的核HMGB1或（K）p21表皮細胞以及（L）基底層核大小。代表性免疫印跡（A、C）或免疫熒光圖像（B、E、G、H、K）顯示在量化右側(cè)。

▼圖6老年表皮表現(xiàn)出NAD穩(wěn)態(tài)紊亂和p21生長停滯增加。

▲ 圖6.衰老破壞表皮NAD穩(wěn)態(tài)并增強p53-p21信號軸。（A）年輕小鼠與老年小鼠表皮NAD的相對水平和NAD代謝相關(guān)基因的（B）mRNA表達。年輕和老年表皮中（C）MAR/PAR?；拿庖哂≯E。（D）賴氨酸乙?；停‥）乙酰基p53（K382）的免疫印跡，右側(cè)為定量。（F）年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠損傷后5天，前緣內(nèi)的表皮p21細胞。右側(cè)的代表性圖像，虛線顯示了從箭頭開始的前緣的前1000μm。（G）用所示NAD前體處理72小時的年輕和老年小鼠的皮膚角質(zhì)形成細胞外植體生長。

通過ECHO Revolve正倒置一體顯微鏡的優(yōu)質(zhì)成像，得到了所需的高清圖片，不僅用于觀察分析，還可使用tiff黑白原圖進行定量分析，最終得到整個結(jié)論。該項研究確定了表皮Pgc-1α通過調(diào)節(jié)細胞NAD+和對p53驅(qū)動的生長停滯的下游影響，在控制表皮修復中的新作用。另外還發(fā)現(xiàn)，衰老表皮中存在明顯的平行機制，表明NAD信號傳導是生理性皮膚修復的重要控制因素，并且該途徑的功能障礙導致了與年齡相關(guān)的傷口修復缺陷。

期刊介紹：

《Molecular Metabolism》致力于作為一個報告能量穩(wěn)態(tài)以及代謝紊亂（如肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥）的病因、發(fā)展、治療和相關(guān)健康后果方面的突破性發(fā)現(xiàn)的平臺。該雜志發(fā)表了以最高標準生成的假說驅(qū)動的研究，為對能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)行為、生理學和功能障礙等機制的理解鋪平了道路。最新影響因子8.568。

Revolve Gen 2正倒置一體電動熒光顯微鏡

新一代Revolve正倒置一體電動熒光顯微鏡，擁有流行的觸屏操控方式，配備智能熒光成像系統(tǒng)，將Z-Stacking全景深成像和DHR數(shù)字處理功能有機聯(lián)合，提升分辨率告別照片模糊，為您打造全新的成像體驗。

前言

結(jié)核?。═B）仍然是單一傳染源的首要死亡原因。2017年，估計出現(xiàn)了超過55萬例耐多藥/利福平結(jié)核?。∕DR/RR-TB）新病例，強調(diào)需要新的治療策略。利奈唑胺（LZD）是一種治療耐藥革蘭氏陽性感染的有效抗生素，也是結(jié)核病的有效治療方法。然而，長期使用LZD可導致LZD相關(guān)的宿主毒性，常見的是gusui抑制。LZD毒性可能由IL-1介導，IL-1是結(jié)核分枝桿菌感染期間早期免疫的重要炎癥途徑。然而，IL-1可導致結(jié)核病進展后期的病理學和疾病嚴重性。

由于IL-1可能有助于LZD毒性，并確實影響結(jié)核病病理學，因此本實驗將這一途徑作為潛在的宿主導向治療（HDT）的靶點。本實驗假設LZD的療效可以通過調(diào)節(jié)IL-1途徑來增強，以減少gusui毒性和結(jié)核相關(guān)炎癥。

本文使用兩種結(jié)核病動物模型進行研究，一種是結(jié)核病易感小鼠模型和臨床相關(guān)獼猴。在本研究中應用Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡首先對小鼠肺組織的病變情況進行觀察，以及肺組織病變面積的測量及可視化呈現(xiàn)；其次觀察獼猴胸骨gusui組織切片，比較細胞數(shù)量和差異性變化。熒光顯微鏡觀察鼠抗CD3e、鼠抗Ly-6G抗體在肺組織中的特異性表達情況。

通過蘇木精-伊紅（HE）染色對WT或Nos2-/-小鼠的單個肺葉進行組織病理學分析。αIL-1R1治療降低了肺臟的平均細菌負荷（圖1）。αIL-1R1治療沒有加重任何一種小鼠株的疾病。

▲ 圖1 蘇木精-伊紅（HE）染色對WT或Nos2-/-小鼠單個肺葉的組織病理學分析結(jié)果

作者使用鼠抗CD3e、鼠抗Ly-6G抗體孵育，在Echo Revolve 4熒光顯微鏡DAPI FITC和RFP3個通道下分別觀察繼發(fā)性熒光和自發(fā)性熒光，將3個通道的圖像疊加，可觀察到圖像中的紫色為抗體在肺組織中特異性表達，見圖2。

由于對Mtb感染和LZD治療產(chǎn)生的IL-1β在很大程度上取決于NLRP3炎癥體，本文還研究了一種方案，其中在感染后56天和77天之間施用LZD和小分子NLRP3yizhi劑（MCC950）。如αIL-1R1所觀察到的，與LZD單獨相比，添加MCC950減少了肺中的PMN數(shù)量，并且沒有顯著改變細菌殺滅（圖2）。

▲ 圖2 不同治療組的肺部組織免疫熒光圖像

用DAPI染色的細胞核（藍色）、用鼠抗CD3ε染色的T細胞（綠色）和用鼠抗Ly-6G染色的中性粒細胞（紅色）

為了證實我們的觀察結(jié)果，病理學家評估了獼猴gusui組織切片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同治療組，如TB組、LZD組和LZD+IL-1Rn組在細胞數(shù)量（髓系：紅系比率）或異常方面沒有明顯差異（圖3）。

▲圖3 獼猴尸檢時獲得的胸骨gusui的代表性HE圖像

圖片中的左側(cè)圖像為20X拍攝結(jié)果，右側(cè)圖像為40X拍攝結(jié)果

研究亮點：

?  本文使用Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡眀場清晰觀察到小鼠肺組織的病灶情況，還清晰觀察到獼猴胸骨gusui細胞分布狀況以及進行不同治療組間細胞數(shù)量比較；眀場可一鍵快速切換到熒光成像，熒光觀察對不同治療組的肺部組織中的抗體特異性表達進行清晰觀察。

?  闡明了小鼠和獼猴之間gusui抑制的差異突出了在人類實驗之前評估多個模型中HDT的重要性；在兩種模型中，IL-1Rn給藥對宿主的影響，以及對Mtb和LZD功效的反應，可以通過顯微鏡觀察兩種模型細胞中的病灶變化，細胞數(shù)量以及差異性變化來鑒定IL-1與LZD聯(lián)合抑制是否對結(jié)核病治療有效。本文研究數(shù)據(jù)為IL-1Rn作為結(jié)核病的潛在治療提供了臨床前數(shù)據(jù)。

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解決方案

       明美工程師得知客戶需求后，上門了解實際情況，老師主要需要熒光顯微鏡和相機對皮膚組織進行觀察，對顯微鏡的要求較高，通過拍攝細胞培養(yǎng)皿對皮膚組織進行分析，工程師推薦了明美高性價比的倒置熒光顯微鏡MF53-LED，另外搭配500W像素的CCD顯微鏡相機MC50-S。

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（來源：http://www.mshot.com/kehuanli/20200226.html廣州市明美光電技術(shù)有限公司）