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  jinbiao8882008 2016-11-21 00:00:00

  以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA。步驟的話應(yīng)該與DNA復(fù)制過程類似，需要的原料是mRNA模板，四中脫氧核糖核苷酸，逆轉(zhuǎn)錄酶，還有能量，注意：這樣獲得的DNA片段不含非編碼區(qū)序列。以下是專業(yè)回答一).構(gòu)建cDNA文庫：以生物細胞的總mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補的雙鏈cDNA，然后接到載體上，轉(zhuǎn)入到宿主后建立的基因文庫就是cDNA文庫。1、mRNA的提取及其完整性的確定1）總RNA的提取RNA提取方法：APGC法或NP-40或應(yīng)用試劑盒提取總RNA2）mRNA的分離高等真核生物mRNA分子的3'端均有poly(A)尾，將總RNA通過寡聚（DT）纖維柱分離mRNA或利用磁珠法制備純mRNA。在某些情況下，裂解細胞后用蔗糖梯度來制備mRNA-核糖體復(fù)合物作為提取mRNA的替換途徑。3）mRNA的純化①按照大小對總mRNA進行分級，主要用瓊脂糖凝膠電泳和蔗糖密度梯度離心法進行分級；②多聚核糖體的免疫學純化法，這是利用抗體來純化合成目的多肽的方法。4）mRNA完整性的確定確定mRNA完整性的方法有三種：①直接檢測mRNA分子的大??；②測定mRNA的轉(zhuǎn)譯能力；③檢測總mRNA指導合成cDNAdiyi鏈長分子的能力。2、cDNA的合成和克隆1）cDNAdiyi鏈的合成用親和層析法得到mRNA后，根據(jù)mRNA分子的3'端有poly(A)尾結(jié)構(gòu)的原理，用12~20個核苷酸長的oligo（dT）與純化的mRNA混合，oligo（dT）會與poly(A)結(jié)合作為反轉(zhuǎn)錄酶的引物，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物是一條RNA-DNA的雜交鏈。oligo（dT）結(jié)合在mRNA的3'端，因此合成全長的cDNA需要反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA分子的一端移動到另一端，有時這種全合成難以達到，尤其是mRNA鏈很長時，為此建立了一種隨機引物法合成cDNA。隨機引物是一種長度為6~10個核苷酸，由4種堿基隨機組成的DNA片段。與oligo（dT）僅與mRNA3'端結(jié)合不同，它們可以在mRNA的不同位點結(jié)合。隨機引物法合成的產(chǎn)物也是RNA-DNA的雜交體。把cDNA克隆到載體中之前，必須把這種雜交體中的RNA轉(zhuǎn)變成DNA鏈，即形成雙鏈DNA分子。2）.雙鏈cDNA的合成合成cDNA第二條鏈有兩種方法。一種方法是利用cDNAdiyi鏈的3'末端常常出現(xiàn)發(fā)夾環(huán)的特征，這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)是反轉(zhuǎn)錄酶在diyi鏈末端“返折”并且進行復(fù)制diyi鏈的結(jié)果，它為合成cDNA第二鏈提供了有用的引物。用這種方法合成的雙鏈cDNA在一端有一個發(fā)夾環(huán)，可以用單鏈特異的S1核酸酶切去。但是S1核酸酶的處理，常常會“修剪”過多的cDNA順序，使cDNA丟失了mRNA5'端的部分順序。另一種方法是用大腸桿菌的RNaseH進行修飾。RNaseH能識別RNA-DNA雜交分子并把其中的RNA切割成短的片段，這些RNA短片段仍與cDNAdiyi鏈結(jié)合，可被新合成的DNA所取代。新合成的DNA存在切口，用DNA連接酶把這些切口連接在一起形成一條完整的DNA鏈。RNaseH法優(yōu)于S1核酸酶法，它能獲得包括mRNA5'端全部或絕大部分的更長順序cDNA分子。3）將cDNA重組到載體上合成的cDNA與載體DNA進行連接一般有3種方法：①借助于末端轉(zhuǎn)移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，雙鏈cDNA和線性化載體DNA的3'-OH端分別加上均聚核苷酸鏈；②雙鏈cDNA和線性化載體DNA分別用Klenow片段進行末端補平，然后用T4DNA連接酶進行齊頭連接，形成重組體；③通過粘性末端連接。4）.轉(zhuǎn)化重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。當不同重組的DNA含有不同的cDNA基因時，整個轉(zhuǎn)化子含有來自mRNA群體的各種cDNA基因，這樣的轉(zhuǎn)化子群體構(gòu)成該mRNA全部遺傳信息的cDNA基因文庫。5）.目的cDNA克隆的鑒定用于從cDNA文庫中篩選和鑒定目的cDNA的方法主要有3種：①核酸雜交②免疫學雜交檢測③cDNA同胞選擇

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