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  洼苴緦ne 2009-05-29 00:00:00

  同學(xué)～給個網(wǎng)址你慢慢看吧！http://202.116.160.122/eol/jpk/course/index.jsp?courseId=1082

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  comlxq 2009-05-29 00:00:00

  你得有設(shè)備才行，光學(xué)顯微鏡一臺。各種儀器，化學(xué)試劑，估計下來建一個實驗室得500萬

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  adsfdsfscz 2009-06-05 00:00:00

  直接買試劑盒了，不用那么麻煩！

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  媽他好乖 2015-12-05 00:00:00

  植物基因組提取及DNA的濃度測定 一、實驗?zāi)康? 1、 掌握用CTAB法提取植物總DNA的方法和基本原理。 2、 學(xué)習(xí)利用紫外分光光度計法測定DNA溶液的濃度。 二、實驗原理 1、2%CTAB抽提緩沖液在65攝氏度水浴中預(yù)熱，與此同時，用剪刀、鑷子取8片約0.2g的子葉于研缽中，放在冰水研至勻漿狀。 2、用移液器向研缽中加入700微升2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪拌。然后將研磨液倒入1.5ml的滅菌離心管中，再置于65攝氏度的恒溫水浴鍋中，每隔10min輕輕搖動，40min后取出。 3、冷卻2min后，用移液器吸700微升的氯仿/異戊醇到離心管中，劇烈振蕩2~3min，使兩者混合均勻。 4、與另一組同學(xué)的離心管平衡，對稱放入離心機中，10000r/min離心10min，與此同時，將60微升的預(yù)冷的異丙醇加入另一個新的滅菌離心管中。 5、移液器輕輕地吸取上清液（約600微升），轉(zhuǎn)入含有異戊醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30s，使異丙醇與水層充分混合至能看到DNA絮狀物。 6、同樣，與另一組同學(xué)的離心管平衡，對稱放入離心機中，10000r/min離心1min，然后立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出。 7、將離心管倒立于濾紙上1min，直立離心管，加入720微升的75%的預(yù)冷的乙醇及80微升5mol/L的乙醇鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中。放置10min，使DNA塊狀物的不純物溶解。 8、與另一組同學(xué)的平衡，對稱放入離心機，10000r/min離心1min，倒掉液體，再加入800微升75%乙醇，將DNA再洗2min。 9、與另一組同學(xué)的平衡，對稱放入離心機，10000r/min離心30s，立即倒掉液體，將離心管倒立于濾紙上，數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA。 10、加入50微升0.5XTE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37攝氏度恒溫箱中約1.5h，消化RNA。 11、取2.99ml蒸餾水至一干凈的試管，再加入上述DNA溶液10微升，混勻。 12、先3ml蒸餾水至比色杯，進行紫外光空白測定，比較兩杯差異，然后倒掉其中一杯蒸餾水，加入3ml已稀釋的DNA溶液，測定260nm及280nm的光吸收值 注意事項： 1、 鑷子、剪刀、研缽、子葉都得用酒精消毒。 2、 葉片磨得越細(xì)越好。 3、 移液器使用時，要注意量程，槍頭加同一液體且沒被溶液污染時，可重復(fù)使用， 加入不同液體或被溶液污染時，要換槍頭。 4、 吸取含DNA時要用剪短的槍頭，減少機械切割力對DNA的破壞。 5、 移液器使用時要始終保持豎直，或稍微傾斜，不可平拿，甚至倒過來，防止液 體進入移液器中，污染移液器。 6、 紫外分光光度計要預(yù)熱。 7、 紫外分光光度計打開蓋，使指示燈指向T，使透光率為0，蓋上蓋，使透光率 為，然后使指示燈指向A，進行測量。 8、 要比較兩杯的差異，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。 四、實驗結(jié)果 A260 A280 裝溶液的比色杯與另一個比色杯的差值 0.005 0.004 溶液 0.118 0.054 溶液的Z終值 0.113 0.05 A260/A280=0.113/0.050=2.26 dsDNA=50*(A260)*稀釋倍數(shù) =50*0.113*300 =1695微克/ml 分析： 1、 采用機械研磨的方法，可破壞植物的組織和細(xì)胞，為了防止勻漿中各種酶類（尤其 是氧化酶類），抽提緩沖液中的B-巰基乙醇可降低這些酶類的活性，同時，在冰上研磨，有兩方面的作用：（1）、降低酶的活性，（2）、使細(xì)胞中水結(jié)晶，細(xì)胞膨脹，利于材料的破碎。 2、 CTAN表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以 游離出來。 3、 抽提緩沖液中的EDTA為金屬螯合劑，能除去勻漿液中的Mg2+和Mn2+，YZDNA 酶的活性。 4、 抽提緩沖液中的Nacl濃度很高，DNP易溶于高鹽溶液，RNP在高鹽溶液中溶解度 不大，以分離DNP和RNP。 5、 氯仿能使蛋白質(zhì)變性，同時有吸收勻漿液中色素的作用。異戊醇防止液相之間起泡， 利于液相分離。這樣DNA溶于上層CTAB抽提液中，細(xì)胞碎片在下層，變性蛋白質(zhì)在中間。 6、 第2步的輕輕振蕩，是為了防止DNA受破壞，第3步的劇烈振蕩是為了DNP中蛋 白質(zhì)與DNA的分離。 7、 異戊醇一方面：除去CTAB，因為CTAB易溶于異丙醇，另一方面：沉淀DNA。 8、 離心后那可除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入預(yù)冷的乙醇使DNA沉淀， 因為DNA難溶于乙醇冷的乙醇效果更佳。 9、 Z后的TE緩沖液中含RNA酶，消化RNA。 10、 抽提緩沖液中Tris-Hcl使DNA保持天然的完整狀態(tài)。 11、 DNA的吸收光譜峰在260nm處，據(jù)計算，測定此波長下DNA溶液的A值， 當(dāng)A260=1時，雙鏈DNA含量約為50微克/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處。如果A260/A280在1.8-2.0時，認(rèn)為以達(dá)到較高的純度，如低于此值其中蛋白質(zhì)較多，如高于此值說明其中含RNA或DNA片段過多。 12、 本實驗A260/A280=2.26>2.0，很可能是DNA片段過多，因為本實驗第5步?jīng)] 用剪短的槍頭。 13、 比較兩比色杯的差異，是因為比色杯可能不標(biāo)準(zhǔn)，會產(chǎn)生小的誤差，通過記錄 兩者的差異，然后通過結(jié)果相減可消除這種差異造成的影響。 14、 DNA溶液的濃度可用dsDNA=50*(A260)*稀釋倍數(shù)來算。

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  z20112012321 2017-12-16 00:00:00

  目的意義 DNA是遺傳信息的載體和基本遺傳物質(zhì)，它在遺傳變異、代謝調(diào)控等方面起著重要作用，是分子生物學(xué)和基因工程研究的對象，但無論是研究植物DNA的結(jié)構(gòu)和功能，還是開展外源DNA的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，首先要做的就是從植物組織中提取天然狀態(tài)的高分子量的純化DNA。因此，本實驗的目的是學(xué)習(xí)植物基因組DNA提取方法、原理和DNA的鑒定技術(shù)。 Ⅰ 植物基因組DNA 的提取（CTAB法） 一、原理 植物組織中絕大部分是核DNA，它和組蛋白、非組蛋白結(jié)合在一起，以核蛋白（即染色質(zhì)或染色體）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。CTAB(十六烷基三甲基溴化銨，hexadecyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)：是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度(0.3mol/L NaCl)時從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 在DNA提取過程中必須始終注意以下幾個關(guān)鍵問題： （1）DNA的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強酸、強堿、加熱、低鹽濃度、有機溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時避免使用變性的條件。 （2）YZ內(nèi)外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜絕，現(xiàn)可以通過多種途徑來做到這一點：a、低溫操作；b、調(diào)節(jié)pH，使偏堿（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（EDTA）除去酶的鋪助因子（Mg2+），使酶活性喪失。 （3）防止化學(xué)降解。如過酸或過堿以及其它化學(xué)因素，會使DNA降解，一般綜合考慮，取pH8.0左右為宜。 （4）防止物理因素降解。如溫度太高或機械張力剪切等，DNA分子特別大，其分子量可達(dá)1012道爾頓，極易被機械張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動也會使DNA斷裂，所以在抽提過程中要特別注意這一點，操作過程要盡量簡便、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要劇烈搖動。 （5）植物的次生代謝物（主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物）對核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料Z好是新鮮的。 分離提取植物DNA的方法很多，本實驗采用CTAB法提取DNA并通過紫外吸收法和電泳鑒定。 二、操作方法 （1） 取200mg樣品(在液氮中研磨成粉末狀)放入1.5mL離心管中，加入600μL DNA提取液，顛倒混勻5-6次。65℃保溫35分鐘以上，其間顛倒混勻一次。 （2）再加等體積的氯仿異戊醇(24：1)溶液輕輕搖晃30秒，在4℃下10000rpm/分鐘離心10分鐘后，取吸上清液(450μL) （3） 再加兩倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻靜止10分鐘以上，在4℃下10000rpm/分鐘離心10分鐘后，棄上清。 （4） 用600μL70%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)一次，在室溫下倒置晾干。 （5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至終濃度50μg/mL，在37℃下保溫半小時，將DNA樣品放入冰箱保存。 Ⅱ 植物DNA 純度的鑒定——紫外分光光度計法 一、原理 由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質(zhì)。核酸在紫外光譜區(qū)有一條典型的吸收曲線，其吸收高峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的吸收高峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)是鑒定核酸的重要依據(jù)之一。但紫外法不能區(qū)分DNA和RNA，只能用來鑒定核酸的純度和含量。 純度鑒定時，需測定在230、260和280nm處的消光值，經(jīng)驗數(shù)據(jù)表明， 純凈的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值過小，說明蛋白未脫凈；A260/A230過小，說明有雜質(zhì)（一般為多酚類或色素）。 含量測定時，對于純凈的DNA來說，在實際應(yīng)用中可根據(jù)260nm處的消光值O.D260值換算成含量，一般認(rèn)為O.D260值為1時，相當(dāng)于50μg/ml。在測定核酸粗制品時，樣品中殘留的蛋白質(zhì)和色素等與其它具紫外吸收的雜質(zhì)對測定有明顯干擾作用，大分子核酸制備過程中變性降解后有增色效應(yīng)，因此有時此法測定的結(jié)果會高于定磷法。 二、實驗材料、儀器及試劑 1、材料 植物DNA 2、器材：紫外分光光度計、移液管、試管 3、試劑：TE溶液（pH8.0）（見前述） 三、操作方法 將純化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀釋至每毫升含5-50μg DNA濃度范圍，用TE（pH8.0）作空白對照，于紫外分光光度計上測定260nm、280nm和230nm吸收值，計算A260/A230和A260/A280的比值，并換算出核酸的含量。 Ⅲ 植物DNA 分子量的測定——瓊脂糖凝膠電泳法 一、原理 以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)的電泳廣泛應(yīng)用于核酸研究中，其操作簡單、快速，是分離、鑒定、純化DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。DNA分子在高于其等電點的pH溶液帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA分子在電場中通過凝膠介質(zhì)而泳動，除電荷效應(yīng)外，還有凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)，也就是說與分子大小構(gòu)象有關(guān)。實驗表明DNA遷移率與其分子量的對數(shù)成反比。因此通過參比已知標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA遷移率，可測定樣品DNA的分子量。用低濃度的熒光物質(zhì)，插入性染料溴化乙錠（EB）使凝膠中DNA區(qū)帶染色，在紫外光下可直接顯示DNA在凝膠中的位置，靈敏度很高，可檢出10ng（10-9g）或更少的DNA含量。 二、實驗材料、儀器及試劑 1、材料： 植物DNA 2、器材：水平板型電泳槽裝置 電泳儀 254nm波長的紫外分析儀塑料手套 移液管 水浴鍋 3、試劑： （1）T ris-HAc(TAE)緩沖液 A．濃縮的貯備液（50倍）每升含：242gTris 57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。 B．使用濃度：0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA。 （2） 瓊脂糖：電泳純以上。 （3）溴酚藍(lán)甘油溶液（0.05%溴酚藍(lán)-50%甘油溶液）：先配制0.1%溴酚藍(lán)水溶液，然后取1份0.1%溴酚藍(lán)溶液與等體積的甘油混合即成。 （4）已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA（λDNA-ECORI/Hind III）。 （5） 10mg/mL溴化乙錠水溶液（EB）或GV水溶液。 三、操作方法 1．瓊脂糖凝膠板的制備 稱取0.7g瓊脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE緩沖液，在沸水浴中加熱至瓊脂糖完全溶解，冷卻至50℃，然后加入EB溶液使終濃度為0.5μg/ml。倒入凹形有機玻璃槽（事先用膠帶封住有機物玻璃板的邊緣）。使其成2mm左右的凝膠板。在其未凝固前將樣品槽模板（梳子）插入凝膠的一端，注意梳齒底與凝膠底之間應(yīng)至少保持0.5-1.0mm的凝膠。待全部凝固后（室溫，約30-45分鐘），取出梳子及除去膠帶，將凝膠板與玻璃板一起放入電泳槽內(nèi)，加入TAE緩沖液使剛好超過凝膠面約1mm。 2．加樣：將樣品與溴酚藍(lán)按4：1的比例混合，用移液器緩慢加入凝膠樣品孔中，點樣量為每孔5μgDNA。 3．電泳：點樣端接負(fù)極，電泳開始時，可用較高的電壓，如100伏特，這樣可使樣品很快進入膠內(nèi)，而減少樣品擴散，待樣品進入膠內(nèi)即可保持每厘米 5伏特左右的電壓，DNA在電泳中向正極移動。當(dāng)溴酚藍(lán)的區(qū)帶移至距凝膠底部1-2cm，停止電泳，當(dāng)膠板為10-15cm的長度時，電泳時間一般為2小時左右。 (4)觀察與鑒定 電泳結(jié)束后，取出凝膠板，在波長為254nm的凝膠成像系統(tǒng)下，觀察電泳圖譜，如果電泳條帶清晰(如果EB染色看到桔黃色熒光條帶，GV染色則看到綠色熒光條帶)，將凝膠照相。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA的電泳圖譜，可以得知樣品DNA的分子大小。

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  碳噫9勺 2016-11-08 00:00:00

  　　植物組織中絕大部分是核DNA，它和組蛋白、非組蛋白結(jié)合在一起，以核蛋白（即染色質(zhì)或染色體）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。十六烷基三甲基溴化銨是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中可溶，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度時，從溶液中沉淀。 　　濃度的測定，需測定在230、260和280nm處的消光值，經(jīng)驗數(shù)據(jù)表明，純凈的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值過小，說明蛋白未脫凈；A260/A230過小，說明有雜質(zhì)（一般為多酚類或色素）。

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