硫氧還蛋白（Thioredoxins）是一系列廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化還原酶，它能通過置換硫代二硫化物來減少二硫鍵的結(jié)合。常用作融合表達標簽的硫氧還蛋白A(TrxA), 分量為11.6kDa，來源于大腸桿菌。

TrxA標簽最獨特的優(yōu)點是它的熱穩(wěn)定性。TrxA本身不作為親和標簽來進行重組蛋白優(yōu)化，而是通過在高溫條件下將雜蛋白變性去除而重組蛋白得以保存。TrxA也具有極好的促溶效率，用作促溶標簽時可將重組蛋白的可溶性表達從12%提高至95%。

下面是針對trx標簽常見問答解析：

①trx標簽蛋白序列

MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA PILDEIADEY QGKLTVAKLN IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL KEFLDANLAG SGSGHMHHHH HHSSGLVPRG

②帶有trx標簽會不會影響蛋白的抗原性

有可能的，trx標簽是比較大的融合標簽，有20多KDa，非常有可能改變蛋白的抗原決定簇。

一般為了不影響蛋白的功能，會在trx標簽和目標蛋白之間加一個酶切位點，比如腸激酶的位點DDDDK，把trx標簽去除掉。

③TRX標簽蛋白怎么純化

一般這個載體中都會有His 標簽，直接用鎳柱純化即可

④常見的蛋白標簽有哪些？有什么特點？

常見的蛋白標簽有His-Tag、FLAG-Tag、HA-Tag、Myc-Tag、SUMO-Tag……

His-Tag

主要應(yīng)用：蛋白純化優(yōu)選，也可用于檢測。

特點：

? 分子量小，不影響目的蛋白的可溶性、結(jié)構(gòu)和功能。

? 可在非離子型表面活性劑存在/變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時表現(xiàn)突出。

? 可應(yīng)用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和。

? 可以和其它的親和標簽一起構(gòu)建雙親和標簽。

? 免疫原性相對較低。

FLAG-Tag

主要應(yīng)用： 廣泛的應(yīng)用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域，在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。

特點：

? 分子量小，不影響融合蛋白功能，比同類標簽更具親水性。

? 目的蛋白可直接通過FLAG標簽進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白且純化效率高。

? 可以被抗FLAG抗體所識別，便于通過WB、ELISA等方法對含有FLAG標簽的融合蛋白進行檢測、鑒定。

? 融合在目的蛋白N端的FLAG標簽，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。

更多關(guān)于蛋白標簽詳情可以參看：https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag

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Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM

新品發(fā)布

2020年11月18日，賽默飛世爾科技發(fā)布了全新的Thermo Scientific Tundra 冷凍透射電子顯微鏡(Cryo-TEM)。這是一種突破性的儀器，它以可承受的價格提供行業(yè)領(lǐng)先的易用性，將冷凍電子顯微鏡（Cryo -EM）擴展到更多的科學家。

賽默飛世爾科技生命科學部副總裁兼總經(jīng)理Trisha Rice 如是說：

“ 冷凍電子顯微鏡可加速對于疾病的理解和ZL。但是，由于成本高昂，并且對于新用戶而言復雜難以操作，因此很多研究院所都認為冷凍電鏡遙不可及。我們與冷凍電子顯微鏡領(lǐng)域的權(quán)威專家合作開發(fā)的這一款儀器不僅可以提供用戶所需的結(jié)果，更重要的是，能讓更多的用戶用上冷凍電子顯微鏡。”

Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM

Tundra極大地簡化了冷凍電子顯微鏡的使用，讓任何經(jīng)驗水平的研究員都能輕松操作， 可提供：

人工智能和引導自動化

可幫助使用者快速鑒定樣品質(zhì)量，并輕松完成原本復雜的工作流程。使用過程中，結(jié)果以“紅綠燈”的方式顯示，便于使用者快速確定樣品是否可用。

集成智能加樣器

能夠快速、輕松和穩(wěn)健地裝載樣品，并轉(zhuǎn)移到顯微鏡上進行即時評估和結(jié)構(gòu)測定。

分辨率高達3.5埃

通過24～72小時數(shù)據(jù)采集，可實現(xiàn)標準樣品3.5埃高分辨率的結(jié)構(gòu)解析。

設(shè)計緊湊，占地面積小

可放在目前大多數(shù)標準尺寸的實驗室中，無需進行實驗室的改造。

賽默飛世爾科技將繼續(xù)推動冷凍電子顯微鏡領(lǐng)域的創(chuàng)新，助力科學發(fā)現(xiàn)，加速對于疾病的理解和ZL。Tundra豐富了Thermo Scientific冷凍電子顯微鏡產(chǎn)品系列，是所有經(jīng)驗水平的用戶都可以使用的一款普及型儀器。它是對中程冷凍電子顯微鏡單顆粒分析(SPA) 的多功能解決方案Thermo Scientific Glacios 冷凍電子顯微鏡以及性能和效率強大的Thermo Scientific Krios冷凍電子顯微鏡的有力補充。這三臺冷凍電子顯微鏡可獨立或聯(lián)合使用，研究人員可根據(jù)自己的研究需要選擇最合適的儀器。

想了解更多新品信息以及樣品演示？

賽默飛將于2020全國電鏡年會召開期間，線上線下同步舉辦Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM新品發(fā)布會及冷凍電鏡技術(shù)演示。現(xiàn)誠邀您蒞臨活動現(xiàn)場或者我們的直播間全程體驗我們的領(lǐng)先科技，與我們的專家面對面探討冷凍電鏡前沿技術(shù)。蒞臨現(xiàn)場更有機會獲得300kV冷凍透射電鏡Krios G4積木一套！

賽默飛冷凍電鏡專場活動日程安排

地點

成都新希望皇冠假日酒店

B1池畔吧/1F 香樟廳

報名方式：掃碼注冊

線下活動報名通道

線上同步直播間

在生命科學領(lǐng)域中，包涵體復體的研究占據(jù)了重要的地位。但隨著研究的深入，一些問題逐漸浮現(xiàn)。本文將對包涵體復體研究中常見的挑戰(zhàn)進行解析，以及為研究者提供一些解決思路。

①包涵體復性原則：

低濃度，平緩梯度，低溫。

②怎樣洗滌包涵體？

通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脫效果好。

③對于尿素和鹽酸胍該怎么選擇

尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。

鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點。

④8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存?

在4度放置半個月，都沒什么問題 。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些處理BI溶液比較好。

⑤復性時的蛋白濃度

一般使用濃度為0.1-1.0mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定，很容易變性。

⑥蛋白復性后濃度低

蛋白可能是在復性的過程中發(fā)生降解了。

可以將復性好的蛋白濃縮一下泡膠看看。復性過程一般都是低濃度蛋白，需要保證分子間有足夠的折疊空間。一些未正確折疊的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出來，復性后的蛋白高速離心看看。

⑦復性中蛋白析出是怎么回事？該怎么處理？

出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。

復性應(yīng)該采取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復性的比率應(yīng)該很低。

若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；

另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。

⑧復性效果的檢測

根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復性效率進行檢測。

凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。

光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。

色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。

生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。

黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。

免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。

⑨變性的融合蛋白可以制備多抗或者單抗嗎？

變性蛋白只是天然蛋白伸直的產(chǎn)物，用來免疫動物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。

⑩純化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎？

免疫動物要求抗原體種盡量小。在這種小體積的情況下，緩沖液里的小分子成分只要沒毒影響就不大，可以不用考慮。

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