重組抗體，也被稱(chēng)為重組免疫球蛋白，是通過(guò)基因工程技術(shù)將抗體的基因在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)并生產(chǎn)出來(lái)的一類(lèi)抗體。與傳統(tǒng)的多克隆抗體和單克隆抗體相比，重組抗體具有更高的特異性和親和力，并且可以針對(duì)特定的抗原表位進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化。

重組抗體的類(lèi)型包括嵌合抗體、雙特異性抗體、抗體片段和Fc融合蛋白等。下面一起來(lái)看一下他們各種的應(yīng)用：https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/recombinant-antibody-overview

①嵌合抗體

1975年，雜交瘤技術(shù)的發(fā)現(xiàn)徹底改變了抗體研究和臨床開(kāi)發(fā)。然而，鼠源性抗體的療-效受到人抗鼠抗體（HAMA）效應(yīng)的限制，鼠源性單抗對(duì)人體具有異種蛋白的免疫原性 ,在人體內(nèi)半衰期較短。1984年，研究人員通過(guò)基因工程構(gòu)建了第一個(gè)嵌合抗體，也是公認(rèn)的第一種重組抗體，以降低鼠源抗體在人體內(nèi)的免疫原性。其中，約30%-35%的分子來(lái)源于小鼠的抗體序列，約65%-70%來(lái)源于人的抗體序列。所得嵌合抗體保留了親代小鼠抗體的抗原結(jié)合能力?？贵w嵌合是開(kāi)發(fā)治-療性人源化抗體的第一步。義翹神州采用CDR移植技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助分子建模，提供高質(zhì)量的單克隆抗體人源化服務(wù)，成功率高，人源化程度>90%。

②抗體片段

每一個(gè)完整的免疫球蛋白（IgG）分子包含通過(guò)二硫鍵連接的兩條重鏈和兩條輕鏈。抗體片段（如Fab、scFv和VHH）體積小，比其全長(zhǎng)抗體具有更好的組織或腫瘤穿透力。因此，它們?cè)诿庖咧?療方面具有巨大的前景，尤其是在實(shí)體瘤方面。此外，它們的半衰期也較短，可用作放射性顯像劑。然而，由于缺乏Fc區(qū)，它們不能引起Fc介導(dǎo)的抗體效應(yīng)功能，如抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（ADCC）和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（CDC）。

起初采用酶解法對(duì)IgG抗體進(jìn)行片段化。胃蛋白酶作用于鉸鏈區(qū)二硫鍵所連接的兩條重鏈的近C端，水解產(chǎn)生被稱(chēng)為F(ab’)2的二價(jià)Fab片段。然后，通過(guò)木瓜蛋白酶將該片段裂解為兩個(gè)相同的Fab片段。然而，酶解法限制了可制備的抗體片段類(lèi)型，而且不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和純化。隨著抗體工程技術(shù)的進(jìn)步，這些問(wèn)題可以通過(guò)重組生產(chǎn)抗體片段來(lái)解決。抗體基因克隆測(cè)序成功后，可通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)（HEK293細(xì)胞）中表達(dá)抗體片段。

憑借豐富的重組生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，義翹神州建立了高通量VHH表達(dá)平臺(tái)，交付了多個(gè)VHH抗體生產(chǎn)項(xiàng)目，總體成功率超過(guò)90%。除了常見(jiàn)的VHH形式，我們還可以表達(dá)雙特異和多特異VHH。此外，義翹神州還可以表達(dá)其他各種高特異性和親和力的抗體片段，如scFv和Fab。

③雙特異性抗體

與常規(guī)單克隆抗體不同，雙特異性抗體（bsAb）具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可識(shí)別同一抗原上兩個(gè)不同抗原或表位。由于這一特性，雙特異性抗體備受研究者和制藥業(yè)的關(guān)注。截止目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)了4種雙抗藥物，而且160多種雙抗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，用于治-療癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病和其他疾病。

起初，雙特異性抗體通過(guò)四源雜交瘤技術(shù)制備，但這對(duì)下游抗體生產(chǎn)和純化構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。隨著過(guò)去20年重組DNA技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了幾種雙特異性抗體形式，以適應(yīng)所需的靶標(biāo)-產(chǎn)品特征。為了解決重鏈錯(cuò)配問(wèn)題，Genentech首先提出了“knob-into-hole”（KiH）技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)對(duì)CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，在每條重鏈中創(chuàng)建一個(gè)“knob”或一個(gè)“hole”，以誘導(dǎo)異源二聚化。同樣地，研究人員也采用了common light chain 和CrossMab等其他技術(shù)來(lái)解決輕鏈錯(cuò)配問(wèn)題。表達(dá)雙特異性抗體主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。由于單克隆抗體和雙特異性抗體之間的各種結(jié)構(gòu)相似性，許多已建立的常規(guī)單抗純化工藝也可適用于雙特異性抗體。（參見(jiàn)另一篇文章：“雙特異性抗體：抗體治-療中的新星”）

④Fc融合蛋白

Fc融合蛋白（又稱(chēng)Fc嵌合融合蛋白、Fc-Ig和Fc標(biāo)簽蛋白）是一種同源二聚體，由免疫球蛋白的Fc段與具有生物學(xué)活性的蛋白分子組成。雖然單克隆抗體是治-療性生物制劑開(kāi)發(fā)的重-點(diǎn)，但Fc融合蛋白也是一類(lèi)成功的生物制藥產(chǎn)品，至少有13種藥物獲得了歐洲藥品管理局（EMA）和美國(guó)FDA的批準(zhǔn)。除治-療應(yīng)用外，F(xiàn)c融合蛋白還是基礎(chǔ)研究中的檢測(cè)試劑，包括流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)和蛋白結(jié)合試驗(yàn)。事實(shí)上，與Fc區(qū)的連接可以提高一些結(jié)合蛋白的溶解度和穩(wěn)定性。鑒于其大小和對(duì)糖基化的需求（大多數(shù)是糖蛋白），F(xiàn)c融合蛋白主要在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。

目前，抗體工程技術(shù)取得了一定的進(jìn)步，這極大地促進(jìn)了各種形式重組抗體的開(kāi)發(fā)，用于疾病治-療。FDA已批準(zhǔn)了100多種抗體藥物，目前有多種抗體處于臨床后期開(kāi)發(fā)階段。此外，重組抗體還可用于許多研究應(yīng)用：蛋白免疫印跡（WB）、免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫熒光（IF）、流式細(xì)胞術(shù)（FC）和表面等離子體共振（SPR）。

總之，重組抗體是基因工程技術(shù)的重要應(yīng)用之一，其類(lèi)型多樣，具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組抗體的生產(chǎn)成本和安全性問(wèn)題也將得到進(jìn)一步優(yōu)化，為臨床治-療和科學(xué)研究提供更多有效的工具。同時(shí)，我們也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到重組抗體的潛在風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)，加強(qiáng)對(duì)其安全性和有效性的評(píng)估和監(jiān)管，以確保其能夠更好地服務(wù)于人類(lèi)的健康事業(yè)。

更多重組抗體詳情關(guān)注：https://cn.sinobiological.com/news/recombinant-antibodies-formats

腺相關(guān)病毒也稱(chēng)腺伴隨病毒，屬于微小病毒科依賴(lài)病毒屬，是目前發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復(fù)制。

重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因ZL和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。

目前用于定量的標(biāo)準(zhǔn)生物分析方法需要3天的感染期和1天的分析時(shí)間，這成為快速工藝優(yōu)化的主要障礙。本篇應(yīng)用采用了強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜法，建立了一種快速定量分析方法[1]，分析時(shí)間可縮短到20 min以?xún)?nèi)。

1 樣品制備

重組腺相關(guān)病毒2型 (rAAV-2) 參考方法[2]制備。

2 分析條件

色譜柱：TSKgel SP-NPR（4.6 mm I.D.×3.5 cm, 2.5 μm）

流動(dòng)相A：50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 100 mM NaCl（pH 7.5）

流動(dòng)相B：50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 500 mM NaCl（pH 7.5）

流速：1.0 mL/min

柱溫：室溫

檢測(cè)器：UV@280 nm

樣品：重組腺相關(guān)病毒2型（rAAV-2）

進(jìn)樣量：10-100 μL（1.0×1011DRP）

3 分析結(jié)果

圖1. 純化后rAAV-2載體分離色譜圖

圖2. rAAV-2載體校正曲線(xiàn)

結(jié)果與討論

采用無(wú)孔強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱TSKgel SP-NPR對(duì)重組腺相關(guān)病毒2型載體進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以在20分鐘內(nèi)完成一次分析。定量線(xiàn)性范圍較寬 (1.0×10¹⁰-5.0×10¹¹DRP, R²值0.997)，可適用于稀釋和濃縮樣品的分析。收集流出峰紫外光譜與進(jìn)樣樣品紫外光譜一致，感染率無(wú)明顯變化，說(shuō)明病毒載體分析后仍保留活性。該方法可廣泛用于過(guò)程開(kāi)發(fā)、基因ZL用重組腺相關(guān)病毒的純化與分析。

TSKgel SP-NPR色譜柱采用了無(wú)孔的親水性聚合物填料，表面鍵合有強(qiáng)陽(yáng)離子交換基團(tuán)，由于其粒徑較小，可實(shí)現(xiàn)快速分離。該色譜柱尤其適合分析腺相關(guān)病毒，并且具有ji高的蛋白回收率。

參考文獻(xiàn)：

1. D. Debelak, J. Fisher, S. Iuliano, D. Sesholtz, D. L. Sloane, E. M. Atkinson, J. Chromatogr. B, 740 (2000) 195-202.

2. K. R. Clark, F. Voulgaropoulou, D.M. Fraley, P.R. Johnson, Human Gene Ther. 6 (1995) 1329–1341.