參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  辦公室的KPI 2008-07-12 00:00:00

  第20章 細(xì)胞基因分離鑒定和原位雜交 diyi節(jié) 細(xì)胞DNA、RNA的分離鑒定技術(shù) 一、培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA的提取及鑒定 人和哺乳動物細(xì)胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚、氯仿抽提，經(jīng)RNase處理和純化來提取DNA，可用于細(xì)胞凋亡中對所引起DNA斷裂、凝膠電泳呈現(xiàn)“梯形”條帶的實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞凋亡章節(jié)中已介紹了有關(guān)DNA的提取和凝膠電泳鑒定，除此之外，提取純化的DNA還可用于分析其結(jié)構(gòu)，序列限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性及其基因定位和克隆。 (一)DNA提取方法： (1)取單層細(xì)胞，經(jīng)無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸液經(jīng)PBS洗2次，棄上清，取細(xì)胞沉淀。 (2)加入2ml細(xì)胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。 (3)50℃水浴2小時，轉(zhuǎn)入37℃水浴過夜，次日加入等體積的飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3分鐘。 12000r/min離心15分鐘（室溫） (4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1)，同樣顛倒混勻，去除蛋白質(zhì) 12000 r/min離心15分鐘（室溫） (5)再重復(fù)步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次 (6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質(zhì)，顛倒混勻 12000 r/min離心15分鐘（室溫） (7)取水相，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，沉淀DNA，混勻-20℃放置1小時 12000 r/min離心15分鐘（室溫） (8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉淀真空干燥10分鐘。 (9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。 (10)加入蛋白酶K至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入Nace至終濃度10mmol/L。 (11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。 (12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。 (13)取水相，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，-20℃ 1小時。 (14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分鐘后溶于少量TE中，4℃貯存。 (二)DNA純度檢測及含量計算 DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位于波長260nm處，蛋白質(zhì)則位于280nm，分別測定后，其OD260/OD280的比值應(yīng)大于1.75.低于此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質(zhì)，此時可用酚、氯仿繼續(xù)抽提純化。若比值大于1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴(yán)重，已成為小分子，因此操作應(yīng)輕柔。 取少許DNA溶液，經(jīng)紫外線掃描，吸收峰值位于波長260nm處，其純度應(yīng)為OD260/OD280=1.8 OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀釋倍數(shù)。 DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積(mL) DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術(shù)還可用作分離基因組DNA，進(jìn)一步進(jìn)行Southern吸印分析。 二、培養(yǎng)細(xì)胞總RNA的提取及鑒定 細(xì)胞中含有三類RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA傳遞蛋白質(zhì)全部遺傳信息是克隆表達(dá)功能性蛋白基因的Z佳來源，是蛋白質(zhì)合成的場所，有特殊意義，不同的細(xì)胞所表達(dá)某種蛋白的mRNA的種類和產(chǎn)量是不同的，為了提高細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的mRNA的種類和產(chǎn)量，通常需加入誘導(dǎo)劑來對細(xì)胞進(jìn)行刺激培養(yǎng)，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。 提取細(xì)胞總RNA的方法，常用強(qiáng)烈變性劑如鹽酸胍溶液處理細(xì)胞，我們在細(xì)胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介紹了異硫氰酸胍一步法，但不純，本文介紹用鹽酸胍來裂解細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，核蛋白二級結(jié)構(gòu)破壞，可利于提取總RNA，也可從總RNA中提取mRNA，從而分析mRNA表達(dá)量，建立cDNA文庫，以及對mRNA的調(diào)控和進(jìn)行反義RNA研究。 變性液：7mol/L鹽酸胍，25m mol/L棕檬酸鈉pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巰基乙醇。 水平衡酚：在飽和酚中加入等體積DEPC處理的三蒸水(或新鮮無菌的三蒸水)混勻后去除水相，再重復(fù)處理二次即可。 所用玻璃、塑料制品、金屬器材可用0.1% DEPC水浸泡過夜后消毒無菌，其中玻璃、金屬器材也可用180℃干烤6小時，以去除被污染的RNA酶。 (一)總RNA的提取方法： 1、消化收集細(xì)胞方法同前。 2、向離心管中的細(xì)胞沉淀物中加1.5mL變性液，立即充分混勻。 3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸鈉PH4.0、以及0.05mL氯仿，劇烈振蕩混勻30秒后，立即置冰上放置15分鐘，4℃ 12000r/min離心15分鐘。 4、取水相，加入等體積酚/氯仿(1:1)混勻，劇烈振蕩10分鐘，4℃12000rpm離心15分鐘。 5、取水相，加入等體積氯仿，劇烈振蕩10分鐘，再同上離心，再如此反復(fù)抽提一次后取水相，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇(或異戊醇)混勻，低溫放置20分鐘，再同上離心。 6、取沉淀用70%預(yù)冷乙醇洗兩次，干燥10分鐘，溶于DEPC處理的三蒸水中以溶解RNA，分裝，-20℃凍存。 (二)總RNA的鑒定及含量計算 1、RNA純度及含量測定 取少量提取的RNA，經(jīng)紫外線掃描，吸收峰位于波長260nm處，RNA純度為OD260/OD280=1.8～2。 OD260值為1的RNA溶液約含有40μg/mL，故RNA濃度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀釋倍數(shù)。 2、RNA分子量大小鑒定 2.1 配液： (1)10×MOPS電泳緩沖液配制 將41.2g[2-(N-瑪琳代)丙磺堿，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL經(jīng)DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉液中，用2mol/L NaoH調(diào)整pH至7.0，加入20mL經(jīng)DEPC處理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加經(jīng)DEPC處理的水至總體積為1000mL過濾CJ，避光室溫保存。 (2)甲醛加樣緩沖液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青FF、 50%甘油 2.2 操作步驟： (1)制平板膠：1.2%瓊脂糖煮沸，冷卻至60℃，加入10×MOPS緩沖液及甲醛溶液，使三者的比例為3.5:1.1:1，或三者的終濃度分別為1.2%、1及10%，于室溫放置30分鐘或更長時間，使膠凝固。 (2)在無菌離心管中混合下列液體。 RNA(Z多30μg) 4.5uL 10×MOPS電泳緩沖液 1.0uL 甲醛 3.5uL 65℃溫育15分鐘，水浴冷卻、離心 (3)加入2ul DEPC處理的加樣緩沖液上樣，進(jìn)行電泳，5V/cm電壓，3小時直到溴酚蘭至膠的中部，可用已知RNA標(biāo)本作分子量標(biāo)準(zhǔn)品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。 (4)電泳完畢，取出凝膠，浸泡在溴化乙錠溶液中(終濃度0.5g/L)染色30～45分鐘，紫外透射儀觀察分子量大小。 第二節(jié) 核酸蛋白轉(zhuǎn)移電泳及雜交 一、DNA Southern Blot及雜交 本技術(shù)可用于基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產(chǎn)前診斷或基因變異等方面的研究有應(yīng)用價值，其過程包括：樣品DNA內(nèi)切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離后水解片斷的轉(zhuǎn)移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。 (一)樣品DNA內(nèi)切酶水解 限制性內(nèi)切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點(diǎn)是具有高度特異性的DNA裂解點(diǎn)和不同電離子強(qiáng)度的特殊反應(yīng)條件。不同產(chǎn)品其反應(yīng)條件不同，應(yīng)根據(jù)說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內(nèi)能將1μg DNA所有特異性位點(diǎn)切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內(nèi)切酶，要注意RE的Z適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進(jìn)行DNA切割。 1、配液：10×限制性酶消化緩沖液 10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4 1mg/mL BSA 100mmoL/L MgCL2 10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇) 10×bnffer L—低鹽：緩沖液O 0.5mol/L Nacl 10×bnffer H—高鹽：緩沖液O 1.0mol/L Nacl 2、操作步驟： (1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中，并加入適量H2O總體積為18μL，混勻。 (2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據(jù)廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。 (3)加1～2U限制性內(nèi)切酶充分混合。 (4)37℃溫育適當(dāng)時間，時間需先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。 (5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達(dá)到終濃度為10mmol/L終止反應(yīng)。 (6)消化后的DNA直接進(jìn)行瓊脂糖電泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。 (二)Southern Blot及雜交。 將經(jīng)電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和后，以毛細(xì)管作用在高鹽緩沖液中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。 1、配液： (1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH (2)中和溶液：200mL 20×SSC 100mL 1mol/L HCL 100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。 (3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/L NaoH調(diào)pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。 (4)預(yù)雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4 125mL 20×SSC 25mL 100×Denhardt'S溶液 5mL 5mg/mL魚精DNA 250mL 去離子甲酰胺 82.5mL H2O(總體積為500mL) (5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400) 10g聚乙烯吡咯烷硐 10g牛血清白蛋白(組分V) 加H2O至500ml 2、操作步驟(如圖20-1)： 圖20-1 Southern Blot裝置圖 (1)內(nèi)切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進(jìn)行12-24瓊脂糖電泳。 (2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察并照像，在膠的旁邊放一尺子。 (3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動： 500mL 0.2mol/L HCL 10分鐘，水洗若干次 500mL變性液中浸泡15分鐘×2 500mL中和溶液浸泡30分鐘。 (4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小于膠3mm。 (5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數(shù)百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側(cè)浸到盤中的溶液。 (6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，并加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉(zhuǎn)移24～36小時 (7)取出該膜，用圓珠筆標(biāo)記方向，放入2×SSC中5分鐘，用濾紙吸干，80℃烘烤2小時。 (8)將該轉(zhuǎn)移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預(yù)雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。 (9)將標(biāo)記的DNA探針煮沸5分鐘，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×105 CPM/ML。 (10)倒去預(yù)雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。 (11)取出轉(zhuǎn)移膜，按以下條件洗膜 1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鐘 0.25SSC，0.1%SDS，42℃ 2×15分鐘，氣中干燥。 (12)將雜交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。 (13)X片顯影、定影，然后讀片 結(jié)果分析：此雜交技術(shù)可以對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。雜交陰性帶的大小，分布規(guī)律及根據(jù)帶條信號強(qiáng)度測量其含量。 二、RNA Northern Blot及雜交 此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨后將RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。 1、配液：Northern 預(yù)雜交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4 125mL 20×SSC 25mL 100×Danhardt's液 5mL 5mg/mL 魚精DNA 250mL 去離子甲酰胺 加H2O 至500mL-20℃貯存 Northern 雜交液：500mL預(yù)雜交液加入標(biāo)記探針及10%磷酸葡聚糖。 2、操作步驟： (1)RNA變性電泳方法同前 (2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數(shù)次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分鐘，輕輕搖動。 (3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側(cè)的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉(zhuǎn)移4～6小時。 (4)取出濾膜80℃烘烤2小時。 (5)用6～10mL Northern預(yù)雜交液，42℃預(yù)雜交過夜。 (6)將已標(biāo)記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。 (7)去除預(yù)雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。 (8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鐘 0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鐘 (9)曝光于X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據(jù)自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。 三、蛋白Western Blot及分析 此項(xiàng)技術(shù)是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結(jié)合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結(jié)合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot，diyi抗體與膜上特異抗原結(jié)合后，再用標(biāo)記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。 1、配液： (1)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0 150mmol/L 甘氨酸 加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL 甲醇，加水至6L (2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S 1%乙酸 2、操作步驟（如圖20-2）： 圖20-2 Western Blot裝置圖 (1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。 (2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移電泳緩沖液中預(yù)濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。 (3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。 (4)將以上“三明治”樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉(zhuǎn)移裝置中，加入電轉(zhuǎn)移緩沖液。 (5)接通電源：使膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉(zhuǎn)移4小時或過夜。 (6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標(biāo)準(zhǔn)染色，在水中完全脫色。 (7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封閉特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。 (8)在封閉緩沖液中稀釋diyi抗體，加入后室溫放置1小時，將濾膜轉(zhuǎn)到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。 (9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，重復(fù)步驟8。 (10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約2～3分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應(yīng)、照像。 結(jié)果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據(jù)信號(顏色)強(qiáng)弱分析蛋白表達(dá)量。 第三節(jié) 細(xì)胞的原位雜交技術(shù) 原位雜交(ISH)是一種可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術(shù)，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補(bǔ)的標(biāo)記單鏈DNA/RNA探針結(jié)合形成標(biāo)記的雙鏈雜交分子，本技術(shù)可對組織細(xì)胞原位的待測核酸分子進(jìn)行定性，定量及定位分析。在細(xì)胞分化調(diào)節(jié)、基因定位、腫瘤遺傳學(xué)、分子病理學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。經(jīng)典的原位雜交技術(shù)包括載玻片處理，組織細(xì)胞的固定，探針的制備或選購，原位雜交，洗滌以及檢測，其中探針制備技術(shù)不屬于本章專業(yè)技術(shù)，故不作具體評敘，略交待制備使用原則。本章節(jié)主要介紹培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交技術(shù)。 一、探針的制備原則和選擇 探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點(diǎn)，探針必須變性、復(fù)性，降低了探針雜交效率，雙鏈探針在溶液中形成長的鏈狀結(jié)構(gòu)傾向，限制了它的組織穿透能力。適用于基因組DNA雜交。由于原位雜交的探針將與高密度的細(xì)胞融合，因此，需要減短探針的長度或增加探針的濃度，但是過高濃度的探針往往會增加非特異性結(jié)合，因此每種探針應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛取?探針的獲得常采用隨機(jī)引物延伸法的PCR合成和擴(kuò)增，可獲大量的DNA探針，或利用帶有噬菌體強(qiáng)啟動子多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒載體來合成RMA探針，也可利用質(zhì)粒菌擴(kuò)增質(zhì)粒，經(jīng)酶切后純化的基因片斷，均可以獲得制備探針原料。這些探針可以用同位素標(biāo)記，也可以用非同位素標(biāo)記，即光敏生物標(biāo)記或配基標(biāo)記于脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的-dUTP，可通過隨機(jī)引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構(gòu)成一配基標(biāo)記的核酸探針。比探針可用抗抗體偶聯(lián)酶或熒光素通過松體結(jié)合和底物顯色或產(chǎn)生熒光來檢測。 這些探針基本均有市售，無需自行制備，只要根據(jù)說明書使用即可。 二、載玻片和蓋玻片預(yù)處理 為了防止探針的非特異貼附而保證細(xì)胞粘附而需處理： 1、用于檢測RNA的載玻片的處理 (1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鐘，再用無水乙醇洗數(shù)次使其干燥。 (2)在下列溶液中，65℃處理2小時 3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。 (3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鐘，180℃烘烤2小時。 2、用于檢測DNA的載玻片的處理 以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂載玻片。 3、對于蓋玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分鐘，用無水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小時。 三、組織細(xì)胞固定 理想的細(xì)胞固定過程應(yīng)該保護(hù)細(xì)胞形態(tài)，同時確保目的基因DNA或RNA序列暴露。對于RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS、賴氨酸、過碘酸鹽及重酪酸鹽）。 1、涂片細(xì)胞原位雜交固定 (1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細(xì)胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收獲細(xì)胞計數(shù)，涂載玻片上。 (2)若檢測RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分鐘，PBS洗5分鐘，系列乙醇脫水干燥，-20℃保存。 (3)若檢測DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小時，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鐘，浸泡在下述溶液中2×5分鐘： 0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鐘。 (4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃處理10分鐘，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鐘。 (5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鐘，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鐘。 注意：對于DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或均可，但對于檢測法必須用4%多聚甲醛，固定至少16小時，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色。 四、原位雜交 原位雜交與鹽濃度、溫度、甲酰胺濃度、pH等有關(guān)，DNA復(fù)性的溫度是16～32℃，DNA-RNA原位雜交，25℃Z佳，RNA-DNA雜交，可用較高溫度，在pH5～9范圍內(nèi)復(fù)性率基本上與pH無關(guān)。Z好選用溫和的堿性條件。甲酰胺有機(jī)溶劑可降低雙鏈核酸的穩(wěn)定性，可避免雜交過程中處于過高的溫度，防止高溫破壞組織。 (一)同位素標(biāo)記DNA探針的原位雜交 同位素標(biāo)記的DNA探針，敏感性高，但要注意非特異結(jié)合，如35S標(biāo)記探針在雜交前，用未經(jīng)標(biāo)記的dUTP預(yù)雜交，可減少非特異，可獲較好的細(xì)胞內(nèi)定位，此外還常用3H或125I標(biāo)記探針，但3H放射線弱，自顯影需100天曝光，不太理想，方法如下： (1)取已形成單層的細(xì)胞的蓋玻片，懸浮細(xì)胞可采用離心法，將細(xì)胞粘附到涂有明膠的載玻片上。組織印片，冰凍切片等標(biāo)本。 (2)將標(biāo)本浸入甲醇固定5分鐘，再過3次4℃預(yù)冷的10%三氯醋酸。 (3)將細(xì)胞片標(biāo)本浸入70%乙醇脫水，空氣干燥，這時培養(yǎng)細(xì)胞蓋玻片應(yīng)該用中性樹膠固定于載玻片上，注意細(xì)胞面向上。 (4)將細(xì)胞片放置在金屬盤內(nèi)，并將托盤放入43℃水浴箱中預(yù)熱。 (5)直接向固定的細(xì)胞面滴加5mL含探針雜交液，然后用16mm蓋玻片覆蓋，其邊緣用橡膠液封閉。 (6)43℃恒溫水浴箱內(nèi)培養(yǎng)18小時，此間保持箱內(nèi)高濕度，防止因蓋玻片封閉不嚴(yán)導(dǎo)致雜交緩沖液干涸。 (7)反應(yīng)結(jié)束后，將玻片置于冰塊上，用鑷子小心剝下蓋玻片周邊的橡膠，將載玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使蓋玻片脫落。 (8)將載玻片放入濕盒中，加2×SSC溶液浸沒玻片，加蓋玻片并用膠帶封閉濕盒。然后，將濕盒移入水浴箱中53℃處理30分鐘。 (9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分鐘。 (10)玻片浸入70%乙醇脫水，空氣干燥。 (11)將干燥后的干燥標(biāo)本浸入新配制的核4乳膠液（核4乳膠液蒸餾水=1:1），垂直取出玻片，用濾紙擦去背面多余膠，室溫干燥5小時（在暗室中進(jìn)行）。 (12)用黑紙包裹標(biāo)本放在4℃冰箱曝光（3H標(biāo)記的探針通常需2～4周，有時需長達(dá)100天，可造成高背景，而不理想）。 (13)按常規(guī)顯影、定影、水洗。 (14)對標(biāo)本進(jìn)行Giemsa或HE染色、脫水、封片。 結(jié)果分析：鏡下觀察，如需定量，可在鏡下計數(shù)銀顆?；蚺臄z顯微照片，用圖象分析儀進(jìn)行灰度分析。 (二)同位素標(biāo)記RNA探針的原位雜交 RNA探針容易制備，合成率較高，成本低，易純化，可提高檢測敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA雜交比DNA-DNA雜交穩(wěn)定，能適應(yīng)更多的條件。 (1)標(biāo)本處理同前 (2)將RNA標(biāo)記探針溶于雜交緩沖液中（5×107CPM/ml放射強(qiáng)度）。 50～70%去離子甲酰胺 2×SSC 0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0 200μg/mL變性魚精DNA 85℃ 5分鐘 (3)每張載玻片上滴加雜交液，使每張載玻片探針總量為2×105CPM，用一硅化的蓋玻片蓋住，封以不透性礦物油，在利于探針的溫度下（常為42℃）雜交7～18小時。 (4)用氯仿洗數(shù)次，去除礦物油，室溫下使蓋玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去離子甲酰胺，0.1×SSC液，雜交溫度下60分鐘，室溫2×SSC洗5分鐘，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除單鏈RNA，再滴加50%～70%去離子甲酰胺，0.1×SSC，室溫15分鐘，室溫下用0.1×SSC洗5分鐘。 (5)將切片脫水，浸入由1%甘油稀釋的放射自顯影乳劑（1:1）中，放入暗盒中，在有硅膠干燥劑存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光膠片24～48小時），隨后浸于液體乳劑。 (6)用HE染色。 (三)標(biāo)記的DNA探針原位雜交 放射性同位素標(biāo)記探針缺點(diǎn)是有放射損傷，易污染環(huán)境，需特殊防護(hù)和實(shí)驗(yàn)條件，有半衰期受限、標(biāo)記不穩(wěn)定及曝光時間長。若改用生物素、乙酰氨基、熒光或標(biāo)記可避免，其中以標(biāo)記探針Z敏感，隨機(jī)引物標(biāo)記，其標(biāo)記率很高，此探針用于原位雜交可獲高敏感性，好的細(xì)胞定位以及低背景。非同位標(biāo)記探針還可以通過雙標(biāo)記原位雜交法，同時測多條DNA序列。 (1)配液：①雜交緩沖液：2×SSC 5%（W/V）磷酸葡聚糖 50%去離子甲酰胺 ②緩沖液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5 0.5mol/L Nacl ③緩沖液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5 0.1mol/L Nacl 5mmol/L MgCl2 (2)操作步驟： ①組織標(biāo)本處理同前。 ②將140ng/mL標(biāo)記的探針加到雜交緩沖液中，每張滴加50μL雜交緩沖液，用蓋玻片蓋住，四周封以樹膠。 ③將目的DNA和DNA探針放入90℃，進(jìn)行變性10分鐘，雙鏈打開，42℃，在潮濕環(huán)境中雜交16小時。 ④去除蓋玻片，按下列條件洗滌： 2×SSC室溫10分鐘→2×SSC室溫10分鐘→0.2×SSC室溫10分鐘→0.2×SSC 42℃ 20分鐘。 ⑤再按以下方法處理： 1) 在緩沖液I中洗30分鐘。 2) 在含有20%羊血清的緩沖液I中洗30分鐘。 3) 滴加1:5000標(biāo)有堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶的抗體，在裝有緩沖液I的濕盒中溫育20分鐘。 4) 在緩沖液I中洗2×20分鐘。 5) 在緩沖液II中洗60分鐘。 6) 加入下述溶液：緩沖液II 0.33mg/mL 四唑氮蘭 0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate 7) 將切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA終止反應(yīng)。 ⑥ 用底物顯色、復(fù)染、脫水、封片，按免疫組化常規(guī)法進(jìn)行。 說明： (1)用不同濃度和不同溫度的鹽溶液洗滌是為了去除探針與不完全同源序列雜交，減少非特異性顯色，其原則鹽濃度由高到低，溫度由低到高洗滌，洗滌過程中切勿使切片干燥。 (2)應(yīng)該有陽性和陰性對照，陽性對照：用該探針與已知含互補(bǔ)序列的組織細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行雜交。陰性對照：①應(yīng)用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未標(biāo)記探針；③不加核酸探針進(jìn)行雜交（空白對照）；④用不含探針DNA的無關(guān)質(zhì)粒DNA替代探針進(jìn)行雜交；⑤同義RNA（Sense probe）進(jìn)行雜交。

  贊(14)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論